常用色谱技术及临床应用

(一)凝胶色谱

凝胶色谱技术又称凝胶层析技术、凝胶排阻、分子筛、凝胶过滤、凝胶渗透色谱。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛,利用这种凝胶分子筛对形状、大小不同的分子进行色谱分析,称为凝胶色谱。

1.凝胶色谱的原理 凝胶色谱是依据分子大小的物理性质进行分离纯化,其固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多网孔,当含有不同分子大小组分的样品进入凝胶色谱柱后,各组分向固定相的网孔内扩散,组分的扩散程度取决于网孔的大小和组分分子大小。比网孔孔径大的分子,不能扩散至网孔内部,因此迅速随流动相流出;比网孔孔径小的分子,则能进入凝胶颗粒内部,流出速度较慢。因此,样品经凝胶色谱后,可按分子从大到小的顺序流出,从而达到分离纯化的目的。凝胶色谱具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物活性等优点。

选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的根本保证,一方面要考虑凝胶的性质,包括凝胶的分离范围、理化性质、强度等非特异吸附性质等;另一方面还应注意到分离目的和样品的性质。常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙乙烯凝胶等。目前生化产品制备中最常用的是葡聚糖凝胶,它是由葡聚糖与其他交联剂交联而成的凝胶,其亲水性很好,在水中极易膨胀,分离范围大,并在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液,以及有机溶剂中都比较稳定,可以多次重复使用。

2.凝胶色谱的应用 ①脱盐:去除高分子(如蛋白质、核酸、多糖)溶液中的低分子杂质。②分离提纯:广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。③测定高分子物质分子量。④高分子溶液的浓缩。⑤去热原物质:去除无离子水中的致热原制备注射用水。

(二)离子交换色谱

离子交换色谱是以具有离子交换性能的物质(离子交换剂)作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆性交换来分离离子型化合物的一种色谱技术。根据与基质共价结合电荷基团的性质不同,分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。

1.离子交换色谱的原理 离子交换色谱的固定相是离子交换剂,通常由不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可分为3部分:高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成带电荷可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液当中的其他离子基团进行可逆性交换,平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换,称为阳离子交换剂。平衡离子带负电的离子交换剂能与带负电的离子基团发生交换,称为阴离子交换剂。在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换色谱的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,可以对溶液中不同的离子基团进行分离。

实用的离子交换剂应满足如下要求:①有高度的不溶性,在离子交换过程中不发生溶解;②有疏松的多孔结构或巨大的表面积,使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换;③有较多的交换基团;④有稳定的理化性质等。常用的阳离子交换剂有聚苯乙烯磺化型阳离子交换树脂、羧甲基纤维素、CM葡聚糖-50。常用的阴离子交换剂有阴离子交换树脂、二乙胺乙基纤维素和二乙胺乙基葡聚糖等。

2.离子交换色谱的应用 广泛用于分离离子或可离解的化合物,如无机离子、有机化合物和生物物质(氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离及蛋白质等电点的测定。

(三)高效液相色谱

高效液相色谱又称为高效液相色谱法(HPLC),是近20年发展起来的一项快速分离技术。它是在经典液相色谱法基础上引进气相色谱的理论,具有气相色谱的全部优点。其基本原理是根据被分离物质的理化性质(如分子大小、溶解度、亲和力、吸附力等)不同而进行的分离。由于HPLC分离能力强、灵敏度高、可在室温进行,因此应用极为广泛,无论是极性还是非极性,小分子还是大分子,热稳定还是不稳定均可用此法测定。对蛋白质、核酸、生物碱、氨基酸、激素等尤为有利。

HPLC通常有三种类型:液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱。

1.液-固吸附色谱 固定相是具有吸附活性的吸附剂,根据固定相对被分离组分吸附力大小不同而将其分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝,适用于分离相对分子质量为200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物。常用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。

2.液-液分配色谱 固定相为单体固定液构成,用特定的液态物质涂于单体表面,或化学键合于单体表面形成固定相。分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度的不同而分离。由于涂布式固定相容易造成固定液流失,现已少用。现多采用化学键合固定相,即将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上,经酸洗、中和、干燥活化后使表面保持一定的硅羟基,这种以化学键合相为固定相的液-液分配色谱又称为化学键合相色谱。本法适用于小分子物质的分离,如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。

3.离子交换色谱 原理与普通离子交换色谱相同。在离子交换高效液相色谱分析中,固定相多采用离子键结合相,故又称离子键结合相色谱。流动相主要是水溶液,p H最好在被分离酸、碱的PK值附近。

(四)亲和色谱

亲和色谱是利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种色谱技术。生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子进行可逆性结合的特性。具有专一亲和力的生物分子对主要有:抗原-抗体、DNA-互补DNA或RNA、酶-底物或竞争性抑制剂、激素(或药物)-受体、维生素-特异结合蛋白、糖蛋白-植物凝集素等。

1.亲和色谱原理 将具有特殊结构的亲和分子制成固定相吸附剂放置于色谱柱内,当被分离的组分混合液通过色谱柱时,与吸附剂具有亲和能力的组分被吸附而滞留于色谱柱内。没有亲和力的组分不被吸附直接流出,从而与被分离的组分分开,然后选用适当的洗脱液,改变结合条件,将被结合的组分洗脱下来。

由于亲和色谱具有高度的专一性,使亲和色谱的分辨率很高,是分离生物大分子物质的一种理想的色谱方法,亲和色谱纯化过程简单、迅速,对分离含量少又不稳定的活性物质尤为有效。但亲和色谱必须针对某一分离对象,制备专一的配基和寻求稳定的条件。因此,亲和色谱的应用范围受到了一定的限制。

2.亲和色谱的应用 亲和色谱主要用于分离核酸,也可用于纯化生物大分子物质、稀溶液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、从纯化的分子中除去残余的污染物等。