重庆地区特异性分枝杆菌噬菌体的分离与裂解肽效能研究

研究者：西南大学附属中学高2017级1班谭剀心

指导教师：西南大学附属中学宋 洁

【摘要】 分枝杆菌在自然界中分布广泛，包括饮用水源和自来水管网系统。分枝杆菌感染都比较难控制。分枝杆菌噬菌体是特异性感染分枝杆菌的病毒，部分裂性噬菌体可以裂解分枝杆菌。因此，分枝杆菌噬菌体研究在环境科学及公共卫生等领域都具有重要意义。全世界已经分离到约六千多株分枝杆菌噬菌体，其中大部分是美国研究者及其中学生参与的“噬菌体猎人”项目分离到。中国本土科学家自主分离的分枝杆菌噬菌体很少。分离新的分枝杆菌噬菌体，研究其生物学特性，以及裂解酶，将有助于控制分枝杆菌在环境中的传播，丰富对噬菌体多样性的认识。噬菌体的裂解性肽段可以与其他化合物分子耦合，成为双功能分子，如与抗疟疾的青蒿素结合，可同时杀灭分枝杆菌和疟原虫。

【关键词】 分枝杆菌噬菌体；耻垢分枝杆菌；生物学特性；裂解肽

一、项目背景

分枝杆菌在自然界中的分布非常广泛，包括空气、土壤、环境水源、动物体表及体液等。结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌是其中常见的烈性致病菌，有些非结核分枝杆菌为条件致病菌。世界各地饮用水源中也发现过非结核分枝杆菌。环境中一些非结核分枝杆菌是院内和自来水管网系统的感染源。饮用水对于人民的生命健康至关重要，但是，目前我国居民饮用水卫生标准中还未涉及分枝杆菌的监测项目和标准。分枝杆菌本身也是降解多环芳香烃的生力军。分枝杆菌噬菌体是特异性感染分枝杆菌的病毒，部分裂性噬菌体可以裂解分枝杆菌，而本身不对环境产生污染。因此，分枝杆菌噬菌体研究对于公共卫生、环境科学等有重要意义。噬菌体用于控制污染细菌是目前研究者们关注的热点。分枝杆菌的噬菌体的研究更备受青睐。分离新的分枝杆菌噬菌体，研究其裂解肽，是进一步深入研究和开发应用噬菌体的基础。所以本研究的主要目的分离新的分枝杆菌噬菌体及其裂解肽。

二、意义

本项目分离得到重庆地区特异性分枝杆噬菌体，丰富了分枝杆菌噬菌体多样性。从污水中分离得分枝杆菌噬菌体，经初步试验，可以特异性地清除水源中的分枝杆菌，达到对非结核分枝杆菌污染的有效控制。研究新的分枝杆菌噬菌体的生物学特性以及裂解酶，将噬菌体的裂解性肽段与青蒿素或其衍生物分子耦合，成为双功能分子，以期产生抗疟和抗结核的双重功效。所以本研究在环境科学及公共卫生领域都有积极意义。

三、创新点

（1）分离重庆地区特有分枝杆菌噬菌体，为噬菌体的研究提供依据。

（2）世界各地饮用水源中检测到有大量的非结核分枝杆菌的存在，并严重缺乏有效的治理方法，本研究从污水中分出的分枝杆菌噬菌体经初步试验，可以特异性地清除水源中的分枝杆菌，达到对非结核分枝杆菌污染的有效控制。

（3）我们拟将噬菌体的裂解性肽段与青蒿素或其衍生物分子耦合，成为双功能分子，同时具备抗疟和抗结核功能。

四、实验方法

（一）材料和仪器

1.材料

污水，耻垢分枝杆菌（mycobacterium smegmatis），氨苄青霉素（Ampicillin， Amp），Middlebrook7H9液体培养基，Middlebrook7H10固体培养基，水琼脂， Tween80。

2.仪器

生化培养箱，THZ C恒温振荡器，PGR仪，凝胶成像系统，电泳系统

（二）采样

在马鞍溪湿地公园，文星湾大桥下小河，西南大学人工湖等地，采集了水样样本3份，采集土壤样本5份见图1。

（三）噬菌体分离纯化

分别取5份土样10g，加入15ml MPbuffer、30μl Amp（50mg/ml）和1ml新鲜培养的耻垢分枝杆菌悬浊液，混匀。于37℃，160r/min培养过夜。

图1 污水与土壤样品采集

分别取三份污水样品300μl，加入新鲜培养的耻垢分枝杆菌宿主菌悬液1m L，LB液体培养基35ml，MPbuffer15ml，Amp（50mg/ml）30μl加Ca Cl2至终浓度1mmol/L，置37℃，160r/min培养过夜。

取培养过夜样品12000r/min离心6min，取上清用0.22μm过滤器过滤除菌。将滤液进行倍比稀释。取1ml耻垢分枝杆菌悬浊液，与3ml滤液混合静置15min。取2ml宿主菌 噬菌体悬液，再加入4ml水琼脂（0.7%的琼脂，1m M Ca Cl2），加入Middlebrook的7H10/Amp平板上，37℃培养过夜。观察噬菌斑形成情况。噬菌斑形成时，挑取透明单个噬菌斑接种至宿主菌培养液中进行扩增，经3～5次反复纯化后得形状大小一致的噬菌斑。

（四）噬菌体效价测定

细菌的裂解液经10000r/min离心后，取上清作连续10倍稀释。培养耻垢分枝杆菌（含20%Tween80）至OD600达到0.6～0.8。用7H9培养基（无Tween80）洗菌体3遍，去除Tween80，用MPbuffer重悬。取500μl耻垢分枝杆菌悬浊液、500μl MPbuffer、4ml水琼脂与10μl不同稀释倍数的噬菌体液混合，平铺于9个Middlebrook的7H10/Amp平板上。37℃过夜培养，观察噬菌斑形成情况并计算滴度。

（五）噬菌体侵染最佳MOI的确定

感染复数（multiplicity of infection，MOI），是噬菌体与宿主菌数目的比例。当噬菌体与宿主菌的比值越大，说明裂解效果越好，则能够产生菌落数最少的噬菌体与宿主菌的比例为该噬菌体最佳感染复数，它是研究噬菌体裂解细菌效能的重要指标之一。培养宿主菌耻垢分枝杆菌至OD600为0.6，按照0.01、0.1、1的比例分别加入噬菌体液，双层平板37℃过夜培养过夜，计数法测定所加入宿主菌的浓度，计算确切感染复数。产生最多噬菌体的MOI为最佳感染复数。

（六）噬菌体一步生长曲线

培养200ml耻垢分枝杆菌（含20%Tween80）至OD600达到0.6～0.8。用新鲜7H9培养基（无Tween80）洗菌体3遍，去除Tween80。在菌液中加入噬菌体，使其MOI达到10。混匀后，37℃温育30min。13000r/min离心30s，取上清，用MPbuffer重悬，置于37℃摇床，110r/min震荡培养。从40min起每隔45min取样50ul，13000r/min离心30s。取上清，倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体滴度。重复实验3次，绘制一步生长曲线。

（七）噬菌体裂解效能实验

采用平板法测定污水中总菌数。分别取一份污水样品10ml，13000r/min离心5min，加入噬菌体悬液1ml，混合5min后倍比稀释8倍，取不同稀释度的混合液1ml，涂布于7H9固体平板培养过夜，计算总菌数。做3个平行。

（八）分枝杆菌噬菌体SWU1lysin基因系统发育树构建

选取西南大学已完成测序工作的分枝杆菌噬菌体SWU1，学习裂解基因的亲缘关系比对方法及构建系统发育树。登陆NCBI，用Blast软件将lysin裂解基因序列与Gen Bank中已有的序列进行比对，用MEGA6构建系统发育树。

（九）比对分枝杆菌噬菌体lysin氨基酸保守序列

登陆NCBI，用Blast软件选择分枝杆菌噬菌体lysin氨基酸序列，任意选择一个噬菌体lysin序列，与搜索出的所有分枝杆菌噬菌体的lysin氨基酸序列进行Blast。

五、结果与讨论

（一）分枝杆菌噬菌体分离

分离到一种噬菌体ZT，噬菌斑的大小、形状如图2所示。

（二）分枝杆菌噬菌体ZT效价

将噬菌体ZT倍比稀释8个浓度后涂板，以及一个不加噬菌体的阴性对照平板（见图3）。选择便于计数的6、7、8号平板计数，利用噬菌体效价=稀释倍数×噬菌斑数×10（PFU/m L），计算噬菌体ZT的效价，取平均值。计算得出噬菌体ZT的效价为1.5×109PFU/m L。

图2 产生噬菌斑的噬菌体

图3 噬菌体8个浓度平板

（三）分枝杆菌噬菌体ZT最佳感染复数

噬菌体ZT和耻垢分枝杆菌的混合比例分别为0.01，0.1，1时，在相同的时间内，当MOI=1时产生最大的裂解效应，噬菌斑分布在了半个面积平板内如图4所示，所以为该噬菌体的最佳感染复数为1。

图4 噬菌体ZT的最佳感染复数实验平板

（四）噬菌体ZT一步生长曲线

将约2×103PFU/m L的噬菌体与约2×102cfu/m L的宿主菌混合培养，从40min开始取样，稀释9个梯度涂板（见图5）。以时间为横坐标，以噬菌体滴度为纵坐标作噬菌体ZT的一步生长曲线图（见图6），噬菌体ZT感染宿主菌的潜伏期为220min左右，爆发时间为180min左右，爆发量为4.5×103（噬菌体终滴度9×103PFU/m L）/（菌液初始浓度2×102cfu/m L）。（见图5中噬菌斑受照片质量影响不清晰，计数结果统计数据参见表1）

表1 噬菌体TY1一步生长实验结果记录表

（续表）

图5 噬菌体ZT各时间点一步生长实验平板

（五）分枝杆菌噬菌体ZT裂解效能实验结果

可以看到噬菌体对三个平行污水样品中的菌体，都有明显得裂解效果（见图6），菌株数目均有大幅减少。

（六）lysin基因系统发育树分析

在Gen Bank中选取比对出与分枝杆 菌 噬 菌 体 Mycobacteriophage SWU1的lysin A基因序列相似度较高的18种噬菌体基因序列，选取与分支杆菌噬菌体Mycobacteriophage SWU1的lysin B基因序列相似度较高的20种噬菌体基因序列。从分枝杆菌噬菌体SWU1Lysin A基因的系统发育树（见图7）以及分枝杆菌噬菌体SWU1Lysin B基因的系统发育树（见图8）可以看出Mycobacteriophage SWU1Lysin A基因与 Mycobacterium phage Chy4， Mycobacterium phage Chy5的同源性达到了98%，Mycobacteriophage SWU1 Lysin B基因与Mycobacterium phage Chy4的同源性达99%，可以推测Mycobacteriophage SWU1与Mycobacterium phage Chy4有较近的亲缘关系。

图6 噬菌体ZT的裂解效能实验结果

图7

图8

（七）确定lysin B氨基酸序列高度保守

图9 Lysin B氨基酸序列保守

六、应用实践及展望

本项目成功地从重庆地区环境污水中分离得到一种分枝杆菌噬菌体，对其生理特性及分枝杆菌的主要裂解基因lysin基因的亲缘关系进行了研究，为寻找具有地区特异性的分枝杆菌噬菌体，探究噬菌体之间的亲缘关系以及其与宿主菌之间的作用机制提供线索。还可以利用噬菌体的高效裂解性和专一性，治理污水中分枝杆菌造成的环境污染。并将在后续试验中将噬菌体的裂解性肽段与其他化合物分子耦合，成为双功能分子，开发噬菌体的综合效能。

由于实验的偶然性和时间关系，裂解肽的工作正在进行中。在现有实验结果基础上，预期我们的下一阶段工作会开创一个崭新的领域。

参考资料

[1]葛淑敏，钱爱东，王铁风.10株牛源非结核分枝杆菌16Sr RNA基因序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32（11）：895897.

[2]王巍.重视非结核分枝杆菌病诊断和治疗的研究[J].传染病信息，2009，22（1）：1417.

[3]VAEREWIJCKMJ，HUYSG，PALOMINOJC，etal.Mycobacteria in drinking water distribution systems：ecology and significance for human health[J].FEMS Microbiology Reviews，2005，29（5）：911934.

[4]张晶，张惠文，李新宇，等.多环芳烃胁迫下稻田土壤细菌及分枝杆菌种群多样性研究[J].中国生态农业学报，2008，2.

[5]李全霞，范丙全，龚明波，等.降解芘的分枝杆菌M11的分离鉴定和降解特性[J].环境科学，2008，29（3）：763768.

[6]刘晓贺，顾敬敏，韩文瑜，等.应用噬菌体GH15和K治疗金黄色葡萄球菌感染[J].微生物学报，2013，53（5）：498506.

[7]陈迪，郑祥，魏源送，等.4种人工湿地填料的f2噬菌体吸附特性[J].环境科学，2013，30 （10）：39043911.

[8]刘伟，王学琴，董世雷.噬菌体及其内溶素的应用研究进展[J].浙江农业学报，2010，22 （5）：702708.

[9]余静丹，史红艳，王丹，等.鲍曼不动杆菌噬菌体生物学特性的研究[J].微生物学杂志， 2013，33（2）：1723.

[10]沈萍，范秀荣.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1999.