烈性噬菌体重组分析

噬菌体极小，只有借助电子显微镜才能看到，那么怎样研究它的遗传与变异规律呢？它有可供识别和研究的遗传性状吗？

噬菌体是一种分子寄生物，需要通过其与寄主细胞的关系来认识，噬菌体的遗传分析也需通过其和寄主细胞的关系来进行。第一个被注意到的性状是它感染细菌后形成的噬菌斑。把一滴含有许多敏感菌和少量噬菌体的混合液加入融化的软琼脂培养基，并铺展于培养皿中。待凝后，置适当的温度培养。培养皿中未感染噬菌体的细菌会迅速地生长并铺满琼脂培养基表面。而在每个感染了噬菌体的细菌中，噬菌体会不断地复制和增殖，最后裂解寄主细胞，释放出大量子裔噬菌体，进而感染邻接的细胞。随之又是复制、增殖、裂解和感染。这个过程的结果是在连续的细菌生长表层上形成透亮的圆斑，这就是噬菌斑的形成过程。噬菌斑是噬菌体感染敏感细菌的周期不断重复的结果，一个噬菌斑反映了由单个噬菌体对一个细菌的原发感染所引起的一系列生物学过程。如果在实验中控制噬菌体和细菌的比例，使每个细菌只能受到一个噬菌体的感染，则细菌平板上的每一个噬菌斑都是起源于单个噬菌体的无性繁殖系，这就是噬菌体遗传分析的起点。

1946年，赫尔希发现了大肠杆菌噬菌体T4的一种变异体，它在寄主细胞中的复制、增殖和溶裂细菌的速度比野生型噬菌体快，所以这种突变噬菌体形成的噬菌斑大而透亮，称为速溶突变型，记作r。

与噬菌体遗传学诞生密切相关的第二类突变体是卢里亚发现的寄主范围变异。大肠杆菌B菌株是噬菌体T4的敏感菌，当大量的B细胞（如108个细胞）和T4混合后培养，可以在培养皿上发现极少量不被噬菌体T4感染的抗性突变菌落，纯化后得到对T4不敏感的抗性品系B/4。如果再将大量的T4（如1010个噬菌体）和B/4混合后培养，又可以发现极少量噬菌斑，从这些噬菌斑中又可分离得到寄主范围发生变化的突变噬菌体，它能感染野生型噬菌体T4所不能感染的B/4细胞，记作h。有两种类型的突变，就可以做噬菌体的杂交重组实验了。

将h＋r-（寄主范围正常，但具有速溶性状）和h-r＋（无速溶性状，但寄主范围扩大）两种突变型噬菌体同时感染大肠杆菌B，然后把子裔噬菌体接种在由B和B/4两种细菌组成的混合菌平板上，结果出现了四种不同的噬菌斑，它们的基因型和在混合菌板上的表型如图2-15。因为野生型噬菌体h＋只能感染B而不能感染B/4，所以在噬菌斑中有B/4菌生长，使噬菌斑发生混浊；相反突变型噬菌体hˉ产生的噬菌斑是透明的，因为它既能感染B细胞又能感染B/4细胞。此外，突变型噬菌体r ˉ形成的噬菌斑比r＋要大。这里我们以B和B/4混合菌板为指示菌组合，使不同基因型的噬菌体显示图2-15中各不相同的特征性表型。对噬菌体来讲，适合的细菌就是它的培养基，能限制某种噬菌体生长的细菌就是选择性培养基，就能对基因重组所产生的具有不同基因型和表型的噬菌体进行选择和表型展示，这种选择是非常有效的，不但可以检出靠得非常近的两个基因之间的重组率，还可以检出一个基因内部不同碱基对之间的重组率。下面着重介绍一下本泽（S.Benzer）的经典工作，他的工作使我们对基因的认识达到了物理学概念和生物学概念的统一。

图2-15　菌体h＋r与h-r＋杂交产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑（引自S.Benzer）

因实验时在培养皿底部衬垫了黑纸，所以越透明的噬菌斑在图中越显深色。

1953年，本泽发现了r突变的另一个重要特性。当本泽把赫尔希选出来的大肠杆菌噬菌体T4的另一株r突变rⅡ感染B和K12两种细菌时，发现rⅡ同时也是寄主范围突变体，即这株r突变型噬菌体在K细胞上呈现出在B细胞平板上不一样的另一种表型（表2-2）。

表2-2　T4rⅡ和rⅡ＋在大肠杆菌B和大肠杆菌K平板上的噬菌斑

进一步分析表明，rⅡ突变型噬菌体能吸附并侵染K菌株，甚至能在K细胞内开始DNA的合成和细胞内其他组分的合成。但是受rⅡ感染的K细胞不产生有感染力的噬菌体，也不会被rⅡ裂解。本泽利用rⅡ能在B细胞上生长，而不能在K细胞上生长这种条件生长特征，建立了一个新的实验系统，进行了rⅡ区基因结构的精细分析。　　

本泽利用r突变的速溶性状在野生型噬菌体群体中筛选出了数以千计的rⅡ突变株，并将这些突变株命名为rⅡ1、rⅡ2、rⅡ3…。然后，利用不同的rⅡ品系间的杂交做rⅡ基因内的重组研究，旨在画出rⅡ基因内各个突变点的精细连锁图。例如，将rⅡ1和rⅡ2混合感染B细胞，再在K细胞平板上检测表型为rⅡ＋的重组体出现的频率，因为只有在rⅡ1和rⅡ2两个突变位点间经过重组成为rⅡ＋才能出现rⅡ＋表型，所以这个rⅡ＋重组体实际上就是rⅡ1和rⅡ＋2。把一系列实验所测得的重组值标在遗传学图上，就得到了一张rⅡ基因内部各突变点之间的连锁图：

本泽的工作告诉我们的第一个事实是：基因并不是突变发生的最基本单位，在一个基因内部可以发生多个突变，所以一个基因内部存在多个突变点，它们中间任何一个点发生了结构改变都会产生突变型表型。他把发生突变的最小单位称为突变子（muton）。

本泽的实验系统具有极高的灵敏度，能检测rⅡ基因中重组频率在106水平的重组子。然而在进行了数以百计的rⅡ突变型噬菌体之间的重组实验后，本泽发现他在实验中能观察到的最小的重组值是10-4。据此他认为在rⅡ基因内部能发生结构重组的最小距离相当于重组频率约为10-4这个范围。他把能发生重组的最小单位称为重组子（recon）。重组只发生于重组子之间，但不能发生于一个重组子的内部。这是本泽的工作告诉我们的第二个事实。

从理论上讲突变子和重组子不一定完全相当，但分子遗传学的大量实验研究表明突变子和重组子都相当于DNA分子中的一个碱基对。