结核分枝杆菌的一般特性

第四章　结核分枝杆菌的一般特性

我国约有活动性肺结核病人600万，每年有25万人死于结核病。结核分枝杆菌是分枝杆菌属中对人类和动物致病的病原菌中最为重要的一种细菌。分枝杆菌属中以结核分枝杆菌感染的发病率最高，约占90%，其次为牛型分枝杆菌，约占5%。

一、形态特征

结核分枝杆菌为微弯、细长，两端稍细的杆菌，长为2～4μm。宽为0.2～0.5μm。多单个散在存在，有时呈条索状或短链排列。在痰液中常平行排列，或两菌在其一端黏附而形成“V”形。结核分枝杆菌虽为革兰阳性杆菌，但用革兰染色法染色多不易染上，故一般用Ziehl－Neelsen染色法染色，即用石炭酸品红染液铺盖于已固定的标本涂片上，加温，酸性乙醇脱色，亚甲蓝染液复染，称为抗酸染色。另有Kinyoun染色法则不需要加温，在操作上较为方便。有的实验室用酚金胺（phenolic auramine）或金胺－若丹民（auramine－rhodamine）荧光色素染色法，在酸性乙醇脱色步骤上稍加修改，并用过锰酸钾复染。在低倍显微镜下即可观察到有发荧光的分枝杆菌。在不同情况下，分枝杆菌的形态不尽相同，常表现为多形性。如组织培养中的结核分枝杆菌较之在痰液或人工培养基上生长者为长且弯。

任何生物性体液或物质都可用直接涂片法检查，但阳性率不高，如痰液标本中必须每毫升痰液中有10 000个细菌方可检出。但如将痰液用酸或碱消化，经离心沉淀后再作涂片检查，则可增加检查的阳性率。胃液浓缩法处理后的阳性直接涂片往往是结核分枝杆菌。痰液标本的革兰染色中，结核分枝杆菌呈现为无色的杆状物，或为弱革兰阳性杆菌。

二、培养特性

结核分枝杆菌是专性需氧菌，在含有5%～10%CO₂的条件下，其生长可以受到刺激。最适生长温度为37℃，但在35～40℃时亦可生长。细菌在固体培养基上增生一代的时间为18～20h；而在液体培养基中增生一代的时间稍快，为14～15h。所以结核分枝杆菌是一种生长缓慢的细菌，培养细菌的时间一般在8天以上，有时要延缓至8周。结核分枝杆菌在固体培养基上的菌落多为粗糙型，菌落表面干燥、隆起、不平，呈结节状或颗粒状，边缘不规则，呈乳白或淡黄色，类似菜花状。牛型分枝杆菌的菌落则为光滑型。因为结核分枝杆菌为专性需氧菌，生长时需要有较多的氧气，在液体培养基中生长时，首先在培养基管底开始生长，然后沿管臂延伸，直达培养基表面，最终在培养基表面形成菌膜。如用这种在表面生长的菌液作细菌对药物的敏感性试验，必将因菌液不匀而使结果不准确。但如在液体培养基内加入Tween－80，则菌液生长均匀，便于试验。结核分枝杆菌的有毒菌株在液体培养基生长时菌体相平行，并可形成条索状结构。

目前常用的固体培养基大致可区分为两种类型：一类以鸡蛋作为培养基础，如Loewenstein－Jensen培养基；另一类则以琼脂为基础，如Middlebrook 7 H11培养基。多数固体培养基中都含有对分枝杆菌有轻度抑制作用的抗菌物质，用以抑制杂菌生长。尚有一些不加抗菌物质的培养基，在这些培养基中细菌生长较快。

BACT EC放射测定系统用以培养分枝杆菌已得到广泛地应用。此种液体培养系统一般因标本中所含菌量的不同，能在9～16天内测定细菌的代谢。在BA CT EC培养瓶中尚加入了抗细菌和抗真菌抗生素以防止污染。痰液和其他易被细菌污染的标本在接种前都应进行去污染处理。无菌标本，如血液、脑脊液、胸腔积液和腹腔积液等则可直接接种至BACTEC瓶。在BACTEC瓶中加入p－硝基－乙酰－氨基－羟基－propiophenone的平行培养中，结核分枝杆菌复合体菌种（包括Mycobacterium bovis，Mycobacterium a f ricanium）的生长受到抑制，而对结核病以外的分枝杆菌则无影响。这一特点可用作一种快速的初步鉴定方法。在对血液标本进行培养时，有人将血液直接接种至含有能溶解血细胞的培养基中，离心沉淀，沉渣涂片和培养。这种溶解沉淀法可用以检测外周血中存在的细胞（主要为巨噬细胞）内的分枝杆菌，这种方法虽在艾滋病病人被分枝杆菌和真菌血流性感染时有一定的用处，但其结果并不优于用BACTEC系统培养血液中的分枝杆菌。

三、生物化学特性

结核分枝杆菌的生化活性较低，不能发酵糖类，触酶活性微弱，68℃加热后活性消失。耐热磷酸酶阴性；Tween－80水解试验阴性，但是硝酸盐还原能力强，也能产生尿素酶；烟酰胺酶试验阳性。

结核分枝杆菌可用一些较为简单的试验与其他分枝杆菌相鉴别。结核分枝杆菌能产生烟酸，还原硝酸盐，产生少量热敏触酶，借此可与非结核分枝杆菌相区分，并且对异烟肼（IN H）敏感。IN H－耐药菌株不产生触酶。牛型分枝杆菌一般为烟酸阴性，不能还原硝酸盐。其他分枝杆菌均为烟酸阴性，不还原硝酸盐，但却可产生大量的热稳触酶，并且对IN H高度耐药。

四、抗原结构

分枝杆菌的细胞组成较为复杂，含有多种大分子复合物，如蛋白质、糖类和脂类，至今尚无可靠的方法可用以检测分枝杆菌抗原的数目。用免疫检定法检出的抗原数目差异很大，如用免疫电泳法检出结核分枝杆菌浓缩培养物滤液中的抗原有14种，但用交叉免疫电泳法所检出者可达100种之多。各个分枝杆菌间在抗原性上有相同之处，故彼此之间可以出现交叉反应。Standford用免疫扩散法将分枝杆菌的可溶性抗原分为4组：其中Ⅰ组抗原可在所有的分枝杆菌中检出；Ⅱ组抗原为缓慢生长的分枝杆菌所共有；Ⅲ组抗原存在于快速生长的分枝杆菌；Ⅳ组抗原为个别分枝杆菌菌种所特有，是一种种属特异性抗原。

Joniski等用电泳法证实结核分枝杆菌有11种主要的抗原，其中抗原1～3为多糖。经鉴定分别为阿拉伯糖甘露糖聚糖、阿拉伯糖半乳糖聚糖和大分子葡聚糖。这些抗原是所有的分枝杆菌所共有的。抗原5则是结核分枝杆菌所特有的抗原特异性糖蛋白。抗原4，6，7，8也都是分枝杆菌所共有的抗原。Celoss等用交叉免疫电泳法研究BCG浓缩培养物滤液的抗原成分，发现有31条清晰、稳定的沉淀线，其中有许多抗原可被其他分枝杆菌的抗血清吸收，表明这些都是分枝杆菌的共有抗原。王洪海等用结核分枝杆菌单克隆抗体亲和层析和蛋白质印迹分析技术分离出结核分枝杆菌培养物滤液中的分子量为35×10³和17.5×10³的蛋白质抗原，显示了血清学反应的特异性。

五、分子生物学特点

可用分子生物学技术检定分枝杆菌的特征，如用高度特异DNA探针的核酸杂交法可用以鉴定结核分枝杆菌及其他分枝杆菌菌种。这项技术须用纯培养细菌进行试验，且在数小时内即可完成。快速核酸扩增技术，如聚合酶链反应（PCR）可用于临床标本中结核分枝杆菌的直接鉴定。这种方法能检出临床标本中10个以下的菌数，而直接涂片阳性的菌数须达到10 000个。PCR法不能鉴别死菌与活菌，曾接受抗菌治疗的病人虽体内的分枝杆菌已被杀灭，但仍有一段时间内为PCR阳性。美国食品和药物管理中心（FDA）推荐两种主要的方法：一种为作用于核糖体RNA的扩增结核分枝杆菌直接试验（GenProbe，San Diego，Calif）；另一种则为作用于DNA的AMPLICOR结核分枝杆菌试验（Roche Molecular Systems Branechburg，NJ）。在涂片阳性病例中核酸扩增法的敏感性和特异性都超过95%，在涂片阴性病例中的特异性也极高。但涂片阴性病例中的敏感性则在40%～77%。有人报告，在一国际性研究中将20个盲选的含有0，100或1 000M牛型分枝杆菌BCG细胞（仅有靶IS6110基因的一个拷贝）的痰液标本分别送往18个国家中的实验室，用各种扩增方法进行检测，结果发现30个实验室中只有5个实验室（16%）能正确地鉴定出这20个标本中是否有分枝杆菌DNA存在，另外17个实验室（57%）报告出假阳性结果。

多数专家认为核酸扩增试验虽可补充但不能代替传统检验方法。如果临床上对于结核病存在的可疑性甚高，而且抗酸染色涂片阳性时，直接扩增试验一般并不需要；当临床可疑性低，抗酸染色涂片阴性时也不需要。此外，如涂片和直接扩增试验均为阳性，结核病的诊断几乎已肯定，而在这两项试验均为阴性时，培养结果也几乎常为阴性。不过当抗酸染色涂片与核酸扩增结果不一致时，就需要有适当的临床判断。

快速确定结核分枝杆菌对药物敏感性的可靠方法是极为需要的。许多研究者进行了广泛的研究，已发现了与耐药型有关的染色体基因突变。利福平对结核分枝杆菌的作用靶是RNA聚合酶的β亚单位，一旦编码这种蛋白质的基因发生突变，利福平就失去了作用靶而使细菌成为耐药性菌株。现已发现有15个突变点，分布在69个碱基上，即在23个氨基酸范围内。最常见者发生在516，526，531位氨基酸位置上，即为rpoB基因位点。INH耐药性较为复杂，由多种基因编码，包括触酶－过氧化物酶基因katG、与脂肪酸生物合成有关的inhA基因、ahpC基因和β^－酮脂酰载体蛋白合酶基因kasA。与吡嗪酰胺（PZA）、乙胺丁醇（ENB）、链霉素（STM）等药物耐药性相关的突变也都得到证实。由此即可发展了许多检定耐药性突变的分子生物学方法，包括DNA测序、异源双链，固相杂交和PCR单链构象多态性分析。一般而言，基因分型检定法的特异性较高，但敏感性则不稳定。如果这一问题能够得以解决，则必将能在临床上应用。

基于限制性片段长度多态性的分子DN A指纹分析检定法现已成为鉴定结核分枝杆菌个别菌株的黄金标准，在标准化的方法中，为限制性内切酶pvuⅡ消化产生的DN A片段，经电泳分离后再用针对一重复DN A序列，即插入序列IS6110的探针显示。因为IS6110的许多拷贝存在于染色体中的很多不同位置，故具有相同限制性片段长度多态性程式的细菌分离物代表相同的菌株，从而使流行病学分析成为可能。牛型分枝杆菌则只含有IS5110的单一拷贝。

六、毒力与致病性

（一）毒力因子

结核分枝杆菌的致病毒力因素尚不清楚，它既无内毒素和外毒素，也无荚膜或侵袭性酶类。Middlwbrook发现有毒菌株在液体培养基内生长时多可形成索状结构，而无毒菌株则无此现象，提示索状结构与毒力之间可能有一定的联系。Bloch用石油醚处理有毒的结核分枝杆菌，从中分离到成分为6，6－双分枝菌酸藻糖（trehalose－6，6－dimycolate）的物质。因其与有毒菌株的索状结构形成有关，故称之为索状因子（cord factor）。少量（0.02 mg）的索状因子反复腹腔内注射至小鼠后可以发生毒性反应，但其在结核分枝杆菌的毒力与致病性上的作用尚不清楚。

此外尚有一些其他物质与结核分枝杆菌的毒力有关，如硫脂质能抑制吞噬细胞中吞噬体和溶酶体的融合，从而使吞噬作用降低，有利于细菌在细胞内的生存。另外，它也可增强索状因子的毒性作用。当然对于结核分枝杆菌的毒力尚应考虑到其他方面的因素，如菌体成分和细菌代谢产物所引起的宿主组织中的改变，以及菌体蛋白所引起的病理性免疫应答，即变态反应等。

（二）毒力的测定

在测定结核分枝杆菌的毒力时，应当选择敏感的实验动物。豚鼠和小鼠对结核分枝杆菌最为敏感；家兔则对牛型分枝杆菌敏感。以选择体重为250～400 g的健康豚鼠或体重为18～20 g的健康小鼠做试验为宜。试验前动物应作OT或PPD试验，呈阴性反应者方可使用。感染途径中最为理想的是气溶胶吸入，较能反映自然感染状况。但是这种感染方式因为设备和实验条件要求较高，难以在一般实验室内进行，故对临床检验并不适用。豚鼠中的常用的感染途径为皮下、腹腔内、肌肉注射，在小鼠中则可用尾静脉注射。注射一定时间后观察局部淋巴结变化，解剖动物，观察肝、脾、肺中的病变。判定毒力的标准有多种，如用半数死亡时间及平均生存时间，引起动物半数死亡的菌液剂量则称为半数致死量（LD50）。另外尚可用Mitchison公式计算致病指数和毒力根指数。

（三）致病性

结核分枝杆菌是引起人类结核病毒力最强的细菌，能够诱发人类中的各种类型的结核感染。这种细菌侵入人体的主要途径是呼吸道。开放性肺结核病人在咳嗽或喷嚏时将含有细菌的微滴排出，形成气溶胶，飘浮于空气之中，被人吸入呼吸道。气溶胶的直径小于5μm时即可到达肺泡，从而诱发肺部感染。肺结核是结核分枝杆菌引起的主要疾病。此外尚可通过血行播散或淋巴道传播而引起身体其他部位的感染，所以它也应当视作为一种全身性的疾病。

牛型分枝杆菌是引起牛的结核病的细菌，但有时亦可引起人类中的感染。

七、抵抗力

结核分枝杆菌因为菌体表面化学结构组成特殊，故对物理和化学因素的抵抗力都较一般致病性细菌为强，但含有芽孢的细菌应除外。

（一）物理因素

1.热力　菌液中的结核分枝杆菌在60℃10～30min、80℃以上的热力5min内都可使菌液中的结核分枝杆菌死亡，可见细菌对热力的抵抗力并不高。痰液中的细菌因有黏液的保护，需煮沸5min方可杀灭结核菌。

2.光线　结核分枝杆菌对太阳光中的紫外光的抵抗力较弱。在直射的日光照射下，细菌2～7h内死亡。将厚度5mm的结核分枝杆菌菌液（内含细菌数0.1mg/ml）在50cm距离中用10W紫外光管照射3min后，即可不见细菌生长。结核病病人衣物、床单等可用日光进行灭菌。

3.干燥　结核分枝杆菌对干燥的抵抗力特别强。干燥痰液中的结核分枝杆菌在暗处可存活数周，染菌的图书上的细菌经3个月后仍存活。大便中的结核分枝杆菌在盛夏能存活3天，在冬天则能存活18天。

（二）化学因素

1.乙醇　75%的乙醇能在5min内杀灭结核分枝杆菌，多用于手的消毒。由于乙醇能使蛋白质凝固，故不适用于痰液的消毒。

2.升汞　升汞（HgCl₂）对结核分枝杆菌的杀灭能力较强，0.1%升汞溶液10min内杀灭结核分枝杆菌。与乙醇相同，升汞也能使蛋白质凝固，所以也不适用于痰液的消毒。

3.石炭酸　1%～2%和5%的石炭酸溶液可分别在5min和30s～1min内杀灭结核杆菌。对于痰液中结核分枝杆菌的消毒，须用5%石炭酸溶液与等量痰液混合，置2h后方可将其完全杀死。

4.甲酚皂（来苏儿）　0.5%、1%、2%甲酚皂溶液杀灭结核分枝杆菌的时间分别为60min，45min，5min。多用于带菌标本的消毒，也可用于浸泡动物尸体。

5.过氧乙酸　0.1%～1.0%的过氧乙酸能在1min至1h内杀灭尿、痰和培养物中的结核分枝杆菌。

6.甲醛　甲醛杀灭结核分枝杆菌需用34h。

（余传霖）

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