的结构特点及其性质

的结构特点及其性质_医学分子生物学

1868年，瑞士外科医生Miescher首次从人的脓细胞核内分离得到一种酸性物质，并被命名为核酸。随后人们又相继从其他种属的细胞核内分离得到类似的物质，并且发现生物界的核酸有两大类，即脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。核酸的发现与Mendel遗传定律的提出基本上是同一时期的事件，然而两者之间的关系，更确切地讲是DNA与基因的关系直到1944年才由McCarty和Avery通过实验得到证实。如今，DNA作为遗传信息的携带者已经得到公认。进一步的研究证实，在某些病毒中，RNA也可以作为遗传信息的携带者。

（一）DNA一级结构——遗传信息储存场所

1．“转化”现象的发现 肺炎球菌在揭示DNA作为遗传信息携带者的研究中发挥了极为重要的作用。早在1928年，英国医生Griffith就发现非致病的R型肺炎球菌（R为英文Rough的缩写）可以转变为致病的S型肺炎球菌（S为英文Smooth的缩写）。他将活的R型肺炎球菌与经过热灭活的S型肺炎球菌共同注射到小鼠体内，引起小鼠发病；而将这两种细菌分别注射给小鼠则不会引起小鼠发病。同时他还从发病的小鼠血液内检测到活的S型肺炎球菌。因此他推测某种物质从灭活的S型肺炎球菌转移到了R型肺炎球菌，并将S型肺炎球菌的致病性带给了R型肺炎球菌。1931年，Dawson和Sia在体外重复了这个转化实验。同时，Alloway利用已经杀死的致病性S型肺炎球菌的提取液，将非致病的R型肺炎球菌在体外转化为致病的肺炎球菌。这一实验为后人进行的提取“转化要素”的工作奠定了基础。

2．“转化要素”的化学本质 1944年，McCarty、MacLeod和Avery在《实验医学杂志》上发表了他们历经将尽10年的实验结果（图1-1A）。他们利用灭活的S型肺炎球菌的无细胞提取液进行了一系列分析，证实了DNA就是将S型肺炎球菌的致病性转移给R型肺炎球菌的物质。这一结论主要基于以下发现。

（1）化学分析的结果提示这种物质符合DNA的性质。

（2）这种物质的光学、超速离心以及电泳特性均符合DNA的特征。

（3）将蛋白质和磷脂从抽提液中去除并不影响转化作用。

（4）用胰蛋白酶和糜蛋白酶处理抽提液不影响转化作用。

（5）用RNA酶处理抽提液也不影响转化作用。

（6）用未被加热的血清处理抽提液则使其丧失转化能力，而人们已知血清中含有一种能够降解DNA的酶。

这一工作成为生物化学发展的重要事件。

在此之前，人们普遍认为蛋白质是遗传物质的携带者，而DNA仅仅起了次要的作用。但由于人们当时对DNA的结构和性质缺乏了解，Avery以及他的同事们无法使人们确信基因是由DNA组成的。实际上，他们自己在文章中的结论也是十分谨慎的，仅仅是概述了一种可能的关系。但是不能否认，他们的工作为“基因是由DNA组成的”这一理论奠定了基础。8年后（1952），Hershey和Chase利用噬菌体证实了DNA的遗传性质（图1-1B）。

3．噬菌体的化学组成 噬菌体十分简单，只包括DNA和蛋白质，在20世纪初已被广泛研究。Avery等的实验结果促使Hershey和Chase把重点放到了噬菌体DNA的研究上。他们用硫（35S）标记噬菌体的蛋白质分子，用磷（32P）标记DNA分子。将这些用放射性核素标记的噬菌体放到含有细菌的培养液中，再经过一系列的实验，或去除噬菌体蛋白质，或去除噬菌体DNA，最终证实噬菌体体内与复制有关的物质是DNA，包裹DNA的蛋白质外壳只起到保护DNA，并帮助DNA注入细菌细胞内的作用。这些实验证实了Avery等在8年前利用不同体系得出的结论：DNA是遗传信息的携带者。1953年，当Watson和Crick在冷泉港会议上公布他们的DNA双螺旋结构时，Hershey和Chase的结果再度以概要形式被宣读，作为DNA具有遗传功能的附加证据。Hershey因此与另外两位从事噬菌体研究的创始人Delbrück和Luria一起获得了1969年的诺贝尔生理学和医学奖。

4．遗传信息储存及遗传密码破译 通过对DNA结构的分析，我们知道DNA是由碱基、脱氧核糖（deoxyribose）和磷酸三种成分组成的大分子（图1-2）。组成DNA的碱基有腺嘌呤（adenine，A）、鸟嘌呤（guanine，G）、胞嘧啶（cytosine，C）和胸腺嘧啶（thymine，T）。在DNA分子的戊糖中，与第2位碳原子（C-2′）相连的羟基上缺少一个氧原子，称为脱氧核糖。

图1-1　两个提示基因由DNA组成的实验

A．Avery和同事发现转化要素是DNA。最上面的两行显示的是当小鼠被注射了加或不加转化要素（从致病菌获得的细胞抽提物）的无毒肺炎链球菌后所发生的情况。当加转化要素的时候，转化要素中的基因将无毒株转化为有毒株从而导致小鼠死亡，随后这些致病株从死亡的小鼠肺部被分离出来。图的后两行显示的是用蛋白酶或核糖核酸酶处理对转化要素没有影响，但是用脱氧核糖核酸酶却能使之失活。B．Hershey和Chase的实验使用了T2噬菌体，每一个T2噬菌体由一个DNA分子及头-尾结构的蛋白质衣壳组成，后者能使噬菌体黏附到细菌并注入基因。噬菌体的DNA用32 P标记，而其蛋白质则用35S标记。在噬菌体感染细菌几分钟以后，振摇培养物使噬菌体的空壳从细菌表面脱落，然后离心培养物，收集离心管底部含有噬菌体基因的细菌沉淀，而相对较轻的噬菌体颗粒被保留在上清液中。Hershey和Chase发现细菌沉淀含有绝大部分32P标记的噬菌体组分（DNA），但仅仅包含了20%的35S标记物质（噬菌体蛋白质）。在第二个实验中，他们发现在感染周期晚期产生的新的噬菌体仅含有1%的亲代噬菌体蛋白质

5．脱氧核糖与碱基 在戊糖的第1位碳原子（C-1′）和嘧啶的第1位氮原子（N-1）或嘌呤的第9位氮原子（N-9）以糖苷键相连构成脱氧核苷（deoxynucleoside）。磷酸与脱氧核苷中的戊糖在第5位碳原子（C-5′）之间通过磷酯键相连，构成脱氧核糖核苷酸，后者靠3′，5′磷酸二酯键连接而形成一条多核苷酸链。这一连接方式决定了DNA的多核苷酸链具有特定的方向性，其5′端为磷酸基、3′端为羟基，以5′-3′或3′-5′来表示（图1-3）。在DNA的一级结构中，脱氧核糖和磷酸都是相同的，核苷酸的差异主要是碱基不同，四种不同碱基的顺序也就代表了核苷酸的顺序。因此，核苷酸序列又称为碱基序列。

图1-2　核苷酸的结构

A．脱氧核糖核苷酸的一般结构，即DNA中的核苷酸的共同结构；B．脱氧核糖核苷酸中的四种碱基

图1-3　一段短的DNA多聚核苷酸序列来说明磷酸二酯键的结构

注意多核苷酸两个末端的化学性质不同

6．重要意义 大多数生物（除RNA病毒以外）的遗传信息都是储存在DNA分子中。这些信息以特定的核苷酸排列顺序储存在DNA分子上，如果核苷酸排列顺序变化，它的生物学含义也就改变。Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型后，曾经指出“碱基的精确顺序就是携带有遗传信息的密码”。然而对“信息”和“密码”内在联系的真正了解却经历了一段相当复杂的路程。“遗传密码”与DNA序列的对应关系最初是由俄国物理学家Gamow提出的。他认为DNA的双螺旋结构提供了20种空间作为容纳氨基酸的“容器”，这些空间的形状取决于周围核苷酸的本质，不同的空间吸引了不同的氨基酸，这些氨基酸靠共价键连接起来形成多肽链。尽管Gamow的这一假设是错误的，但是他的关于遗传密码的想法，即核苷酸与氨基酸之间的对应关系还是被人们接受了。随着人们对tRNA的发现、对ATP在蛋白质合成过程中的作用的认识，以及放射性核素标记氨基酸技术的应用，Matthaei与Nirenberg于1961年成功地利用多聚尿嘧啶合成了苯丙氨酸肽链第一个遗传密码，到1966年所有的密码子全部被鉴定清楚。我们现在已经知道DNA分子主要携带两类遗传信息。一类是有功能活性的DNA序列携带的信息，这些信息能够通过转录过程而转变成RNA（如mRNA、tRNA、rRNA）的序列，其中mRNA的序列中又含有蛋白质多肽链的氨基酸序列信息。另一类信息为调控信息，这是一些特定的DNA区段，能够被各种蛋白质分子特异性识别和结合。

（二）DNA的双螺旋结构及其意义

Watson和Crick于20世纪50年代否定了DNA的单螺旋结构和三螺旋结构，提出DNA是由两条多核苷酸单链结合形成的双螺旋（double helix）结构，并对这一结构进行了详细的描述。同时，他们还提出了DNA复制的假说。他们的发现是对人类遗传学的重大贡献，并因此于1962年与Wilkins一起获得了诺贝尔生理学和医学奖。Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型的建立是20世纪生物学最重要的发现。近年的研究证实双链DNA在生物体内可以形成各种不同的构型。

1．双螺旋结构被发现及其特点 人们对DNA生物学性质的认识远远早于对其结构的了解。如前所述，早在40年代科学家们就已经发现DNA在不同菌种之间的转移可以将遗传信息从一个菌种转移到另一个菌种。许多证据表明DNA分子一定是由两条或更多条多核苷酸单链以某种方式组成的。20世纪50年代初期，Wilkins和Franklin等对DNA的X射线衍射照片进行了分析，推测出与Watson和Crick提出的模型相一致的DNA结构，为DNA双螺旋结构模型的建立提供了宝贵的数据资料。正是由于这些线索，为Watson和Crick的DNA双螺旋模型提供了重要的根据。Watson和Crick的DNA双螺旋结构的特点主要包括以下几点（图1-4）。

（1）两条多核苷酸单链以相反的方向互相缠绕形成右手螺旋结构。

（2）在这条双螺旋DNA链中，脱氧核糖与磷酸是亲水的，位于螺旋的外侧，而碱基是疏水的，处于螺旋内部。

（3）螺旋链的直径为2．37nm，每个螺旋含10个碱基对（base pair，bp），其高度约为3．54nm。

（4）由疏水作用造成的碱基堆积力（base tacking）和两条链间由于碱基配对形成的氢键是保持螺旋结构稳定性的主要作用力，A与T配对形成2个氢键，G与C配对形成3个氢键，配对的碱基在同一平面上，与螺旋轴相垂直。

（5）碱基可以在多核苷酸链中以任何排列顺序存在。

图1-4　DNA双螺旋结构

A．双螺旋结构的两种表示形式。左边的结构图中，用条带表示每个核苷酸的糖基磷酸骨架，用黑色标记碱基对。右边的结构图中给出了三对碱基的化学结构。B．A和T配对，G和C配对。用轮廓图表示碱基，用虚线表示氢键。注意G-C碱基对有3个氢键，而A-T碱基对只有两个

两条多核苷酸单链通过碱基配对（base pairing）形成氢键，不仅是保持双螺旋结构稳定的主要作用力，更重要的是碱基配对的生物学含义。由于几何形状等原因，A只能与T配对，G只能与C配对，这种配对原则称为碱基互补配对。Chargaff的研究结果也完全支持这一结论（图1-5），即A与T、G与C的比值在不同生物中几乎都是1。这就意味着在DNA复制过程中，以预先存在的DNA链作为模板就可以得到一条与其完全互补的子链，由此可以保证遗传信息的准确传递。

Watson和Crick的DNA双螺旋结构称为B型结构，是细胞内DNA存在的主要形式。当测定条件改变，尤其是湿度改变时，B型DNA双螺旋结构会发生一些变化。例如，A型DNA双螺旋结构直径为2．55nm，每个螺旋含11个碱基对，其高度约为3．3nm。DNA双螺旋结构的其他构型变化还包括C、D等（表1-1）。

表1-1　DNA双螺旋的主要参数

注：＊构象可变；＊＊与嘧啶相连为C2内型构象，与嘌呤相连为C3外形构象

在自然界原核生物和真核生物基因组中还发现左手双螺旋DNA，其分子螺旋的方向与右手双螺旋DNA的方向相反，称为Z形螺旋（图1-6）。左手双螺旋DNA可能参与基因表达的调控，但其确切的生物学功能尚待研究。

图1-5　Chargaff的碱基比例实验

从各种生物中抽提出DNA，用酸水解磷酸二酯键，释放出单个核苷酸。用色谱检测每一种核苷酸的含量。图中给出了Chargaff的某些实验结果。可以看到包括实验误差在内，腺嘌呤和胸腺嘧啶含量相等，鸟嘌呤和胞嘧啶含量相等

图1-6　DNA双螺旋结构的不同构型

B-DNA（左）、A-DNA（中）、Z-DNA（右）的结构。空间填充模型（上）以及结构模型（下）阐释了DNA分子的不同构象。请注意螺旋的直径、所有完整螺旋所包含的碱基对的数目以及在这些分子间大沟、小沟的拓扑学方面的差异

DNA双螺旋结构不同构型的意义并不在于其螺旋直径及其高度的变化，关键是由于这些变化而引起的表面结构的改变（图1-6），进而影响其生物学功能。B型DNA双螺旋的表面并不是完全平滑的，而是沿其长轴有两个不同大小的沟。其中一个相对较深、较宽，称为大沟；另外一个相对较浅、较窄，称为小沟。A型螺旋也有两个沟，其中大沟更深，小沟更浅但较宽；Z形螺旋则仅呈现一个很窄很深的沟。DNA双螺旋的这种表面结构有助于DNA结合蛋白识别并结合特定的DNA序列。而这种表面构型的变化对于基因组DNA与其DNA结合蛋白的特异性相互作用具有重要的意义。

2．其他类型的DNA结构 虽然双螺旋结构是DNA最常见的二级结构形式，DNA也可以形成不同于双螺旋的其他结构。

（1）三股螺旋DNA（triplex）：也称为三链DNA（triple strand DNA，tsDNA），其结构是在DNA双螺旋结构的基础上形成的。双螺旋通过Watson-Crick氢键稳定，而三股螺旋尚需通过Hoogsteen氢键稳定（图1-7）。

图1-7　三股螺旋DNA结构

三条链均为同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。根据三链的组成和相对位置分为两种基本类型：①嘌呤-嘌呤-嘧啶型（Pu-Pu-Py型，Pu代表嘌呤，Py代表嘧啶），在碱性介质中稳定；②嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Py-Pu-Py型）在偏酸性pH中稳定。其中两条链为正常双螺旋，第三条嘧啶链位于双螺旋的大沟中，它与Pu链的方向一致，并随双螺旋结构一起旋转。三链DNA的两种类型有4种同分异构体。三链中碱基配对符合Hoogsteen模型，第三碱基在Py-Pu-Py型中为T＝A＝T、C＋≡G≡C（与鸟嘌呤形成Hoogsteen键的“C”必须质子化）配对；在Pu-Pu-Py型中存在G≡G≡C、A＝A＝T配对。当DNA双链中含有H-回文序列（H-palindrone）时，即某区段DNA两条链分别为Hpu和Hpy，并且各自为回文结构时，任一条回文结构的5′和3′部分都可以形成分子内三股螺旋结构及剩余的半条回文结构游离单链。在一定条件下，含H-回文序列DNA还可形成小瘤DNA（nodule DNA），它在中性溶液中稳定。

真核生物基因组中存在大量可形成三链DNA的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷酸序列。这些序列有的存在于调控区，有的位于DNA复制的起点或终点，有的则位于染色体重组位点，提示它们可能与基因的表达调控、DNA的复制及染色体的重组有关。

（2）“十”字形结构：其分子基础是DNA分子中存在翻转重复序列。此时，不仅两条链互补，单链中的翻转重复区也可以互相配对形成双链分子。DNA变性后或因其他原因引起DNA分子两条链分开，再复性时翻转重复区的DNA可以自我配对，形成突出于双链之外的发卡结构（hairpin structure），两个并列的发卡形成十字结构（图1-8）。与DNA双螺旋结构相比，十字形结构中氢键形成减少，而且失去了双螺旋DNA碱基堆积力的相互作用，因而稳定性不如双螺旋DNA。十字形结构可能在基因表达调控中有作用，但其确切的生物学功能有待研究。

图1-8　DNA“十”字形结构

图1-9　超螺旋结构

显示了一个环状、双链DNA分子如何解链形成负超螺旋

（3）DNA超螺旋结构：DNA双螺旋进一步盘曲形成更加复杂的结构称为DNA的三级结构，即超螺旋结构（supercoil）（图1-9）。超螺旋的形成如果是由双螺旋绕数减少所引起的就称为负超螺旋，反之称为正超螺旋。生物体的闭环DNA都以超螺旋形式存在，如细菌质粒、一些病毒、线粒体的DNA等。线性DNA分子或环状DNA分子中有一条链有缺口时均不能形成超螺旋结构。真核生物染色体（chromosome）DNA成线性，其三级结构是DNA双链进一步盘绕在以组蛋白（H2A，H2B，H3，H4分子）为核心的结构表面，构成核小体（nucleosome）。许多核小体连接成串珠状，再经过反复盘旋折叠最后形成染色单体（chromatid）。染色质纤维经过几次卷曲折叠后，DNA形成复杂的多层次超螺旋结构，其长度大大压缩。

超螺旋可能有两方面的生物学意义：①超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子体积变得更小，对其在细胞的包装过程更为有利；②超螺旋能影响双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与其他分子（如酶、蛋白质）之间的相互作用。

（三）DNA的理化性质及应用

DNA作为生物大分子具有一些特殊的理化性质。

1．一般理化性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性，在酸性条件下比较稳定，而在碱性条件下容易降解。核酸属于大分子，已知最小的核酸分子如tRNA，其分子量也在20 000以上。线性高分子DNA的黏度极大，在机械力的作用下容易发生断裂。因此在提取完整的基因组DNA时，具有一定的难度，一是提取的DNA不容易完全溶解，二是DNA容易发生断裂。而RNA分子远小于DNA，黏度也比较小。但由于RNA酶的广泛存在，在提取RNA时极易发生降解。

2．紫外吸收 核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共轭双键，使核酸分子在250～280nm波长处有光吸收，其最大吸收峰在260nm处。这个性质可用于核酸的定量测定。核酸在260nm的光吸收值又称为OD260值。一个OD260值所含的核酸量对单链DNA、双链DNA、寡核苷酸以及RNA均有所不同。例如，一个OD260值包含50μg双链DNA，40μgRNA，33μg单链DNA。

3．变性、复性与杂交 DNA双链以碱基之间形成氢键，相互配对而连接在一起。氢键是一种次级键，能量较低，容易受到破坏而使DNA双链分开。氢键的形成是一个自由能降低的过程，可以自发生成。局部分开的碱基对又可以重新形成氢键，使其恢复双螺旋结构。这使得DNA在生理条件下能够迅速分开和再形成，从而保证DNA生物学功能的行使。

（1）变性：双螺旋的稳定靠碱基堆积力和氢键的相互作用来共同维持。如果因为某种因素破坏了这两种非共价键力，导致DNA两条链完全解离，就称为变性（denaturation）。导致变性的因素可以有温度过高、盐浓度过低及酸碱过强等。DNA变性是二级结构的破坏、双螺旋解体的过程，碱基对氢键断开，碱基堆积力遭到破坏，但不伴随共价键的断裂，这有别于DNA一级结构破坏引起的DNA降解过程。DNA变性常伴随一些物理性质的改变，如黏度降低、浮力密度增加，尤其重要的是光密度的改变。如前所述，核酸分子中碱基杂环的共轭双键使核酸在260nm波长处有特征性光吸收。在双螺旋结构中，平行碱基堆积时，相邻碱基之间的相互作用会导致双螺旋DNA在波长260nm的光吸收比相同组成的游离核苷酸混合物的光吸收值低40%，这种现象称为减色（hypochromic）效应。DNA变性后立即引起这一效应的降低，与未发生变性的相同浓度DNA溶液相比，变性DNA在波长260nm的光吸收增强，这一现象称为增色（hyperchromic）效应。利用增色效应可以在波长260nm处监测温度变化引起的DNA变性过程。DNA的变性发生在一定的温度范围内，这个温度范围的中点称为融解温度（melting temperature），用Tm表示，即：使DNA分子内50%的双螺旋结构被解开的温度。Tm值与DNA的碱基组成和变性条件有关。DNA分子的GC含量越高，Tm值也越大，每增加1%（G＋C），Tm增加0．4℃。Tm值还与DNA分子的长度有关，DNA分子越长，Tm值越大。此外，溶液离子浓度增高也可以使Tm值增大。

（2）复性：DNA的变性是一个可逆过程，在适宜条件下，如温度或pH逐渐恢复到生理范围，分离的DNA双链可以自动退火（annealing），再次互补结合形成双螺旋，这个过程称为复性（renaturation）。复性过程的发生主要与温度、盐浓度以及两条链之间碱基互补的程度有关。复性时互补链之间的碱基互相配对，这个过程可以分为两个阶段。首先，溶液中的单链DNA随即碰撞，如果它们之间的序列有互补关系，两条链经GC，AT配对，产生短的双螺旋区；然后碱基配对区沿着DNA分子延伸形成双链DNA分子。DNA复性后，由变性引起的性质改变也得以恢复。DNA复性的速度可以用下列公式来表示：Co·t＝1／K，C代表在t时间单链DNA的浓度，K代表复性速度常数（单位是浓度／时间）。控制复性反应的参数是DNA浓度（Co）和保温时间（t）的乘积。达到半复性时的Co·t称为Co·t，Co·t越大，反应就越慢。复性的分子基础是碱基配对。不同来源的核酸变性后，混合在一起，只要这些核酸分子中含有可以形成碱基互补配对的序列，复性就可以发生。复性可以发生在碱基完全互补配对的序列之间，也可以在一定条件下发生在具有一定相似性（similarity）或同源性（homology）的碱基序列之间。DNA变性和复性的这种性质是核酸分子杂交的基础。

（3）分子杂交：复性发生在不同来源的核酸链之间，形成杂化双链（heteroduplex）的过程称为杂交（hybridization）。不同来源的DNA可以杂交，DNA与RNA以及RNA之间也可以杂交。