基因定位的方法

第1节　基因定位的方法

基因定位可从家系分析、细胞、染色体和分子水平等方面进行研究。

（一）体细胞杂交法

体细胞是生物体除生殖细胞以外的所有细胞。将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传学研究的学科称为体细胞遗传学（somatic genetics）。体外培养细胞可人为控制或改变环境条件，并可建立细胞株，长期保存，以进行各种正常和病理研究。

体细胞杂交（somatic cell hybridization）又称细胞融合（cell fusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybrid cell），含有双亲不同的染色体。

杂种细胞有一个重要的特点，就是在其繁殖传代过程中保留啮齿类一方的染色体，而人类染色体逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人类染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。

图11－2　体细胞杂交基因定位示意图

由于人类细胞和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号染色体上（图11－2）。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。

（二）克隆嵌板法

克隆嵌板法（clone panel method）是应用杂种细胞保留或丢失人类染色体有时有重叠现象而设计的一种简便有用的基因定位方法。如表11－1所示，选择3个都保留有4条人类染色体的杂种细胞克隆，但染色体各不相同。如果某一表型特征只出现于A、C克隆而不见于B克隆，就可决定该特征的基因只能在第3号染色体上，因为A、C克隆都有第3号染色体，而B克隆则无；其他亦可同理判断。这3个克隆可对8条（2³＝8）染色体作出判断；如果是5个克隆（2⁵＝32），就可对人类22条常染色体和2条性染色体作出判断。例如，半乳糖激酶（GK）、尿苷－磷酸激酶（UMPK）和氨基己糖苷酶A（HEXA）的基因就是用此法分别定位于人的第17号、第1号和第15号染色体上的。此外，还可对杂种细胞进行特殊染色，来识别杂种细胞中人类和鼠类的染色体，以助于基因定位。

表11－1　克隆嵌板示意

在体细胞杂交的基础上还发展了微细胞（micro cell）技术，即制备只含少数或一条人类染色体的微细胞进行细胞杂交；也可分离人类中期染色体，将其直接转移到鼠类细胞中，使人类染色体在受体细胞中裂解变成短的DNA片段，并整合到受体细胞的基因组中。如果两个基因同时整合进去，就可以证明它们的紧密连锁关系。

（三）原位杂交和荧光原位杂交

重组DNA技术的建立与分子杂交相结合，从分子水平研究基因定位，发展了一系列有效的方法。例如原位杂交（in situ hybridization）就是分子杂交技术在基因定位中的应用，也是一种直接进行基因定位的方法。

原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。所谓原位，即指标本上DNA原位变性，在利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针杂交后，通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位置，从而进行准确的基因定位。但原位杂交必须在已知探针的情况下进行，而在未知致病基因时，则无法进行基因定位。

放射性同位素标记核酸探针与染色体显带结合进行原位杂交仍有不少缺点和局限性。例如：需要使用放射性同位素的特殊实验室、自显影曝光时间长、同位素标记的探针不易保存、放射污染不利于健康，特别是高质量的中期染色体标本在细胞培养的基础上难以获得、观察费时、对间期核的研究难以进行等。

（四）连锁分析

基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在两个相邻的基因座位，距离较远，发生交换的机会较多，则出现基因重组；若两者距离较近，则重组机会较少。重组DNA和分子克隆技术的出现，导致许多遗传标记多态位点的发现。利用某个拟定位的基因是否与某个遗传存在连锁关系，以及连锁的紧密程度，就能将该基因定位到染色体的一定部位上。

染色体上两个位点从亲代传给子代时，若相距1cM，就有1%的重组机会。整个人类基因组为3.2×109 bp，相应的约3300cM；每个染色体平均约150cM，1cM约为1000kb。因此，一个致病基因和标记位点紧密连锁，两者不需在同一条染色体的同一区段。一条染色体可以产生大量的DNA多态，只要提供足够的家系，按孟德尔方式遗传的疾病都可将其基因定位。

在人类基因组中还存在50000～100000个串联重复序列家族，它们均匀分布于基因组，平均50kb有一个，这些都是很好的遗传标记，对突变的检测和基因定位研究起了重要作用。

此外，还可利用染色体自身结构及染色体畸变法进行缺失作图和基因剂量法等。总之，人们已不只是用单一技术进行基因定位，而是将细胞、染色体和分子水平技术结合起来，综合分析，互相印证，以达到快速、准确的目的。