杂交瘤细胞单克隆抗体的制备过程

单元三　单克隆抗体的制备

由最初一个细胞无性繁殖而形成的纯细胞集团，称一个克隆（clone）。体内有许多识别不同抗原决定簇的B淋巴细胞克隆。一个B细胞克隆只能识别一种抗原决定簇。单克隆抗体（monoclonal　antibody，McAb）是指由单个B细胞克隆产生的针对一种抗原表位、结构相同、功能均一的高特异性抗体。为获得McAb必须选出单个B淋巴细胞克隆，然而该细胞在体外是不能长期存活的，必须将它们变为能长期传代的细胞，才能持续产生单一特异性抗体，基于这一设想，1975年，由Kohler和Milstein创立了B细胞杂交瘤技术。

一、单克隆抗体制备的基本原理

目前常用的单克隆抗体制备技术是鼠－鼠B淋巴细胞杂交瘤技术。该技术是先将抗原免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞在融合剂作用下进行融合，然后用HAT选择培养基进行培养，筛选出能同时表达两个亲代细胞性能的杂交瘤细胞株并扩大培养（即克隆化），最终获得既能产生特异性单克隆抗体，又能体外长期增殖的杂交瘤细胞系。将其进行体外培养或动物腹腔接种培养，其培养液中可得到大量的单克隆抗体。

二、单克隆抗体制备的流程与方法

单克隆抗体的制备是一项周期性长和高连续性的实验技术，涉及大量细胞培养以及免疫化学等方法，其制备的基本流程是：抗原的纯化与动物免疫、骨髓瘤细胞、B细胞及饲养细胞的制备、细胞融合，杂交瘤细胞的筛选、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与细胞冻存，单克隆抗体的制备、单克隆抗体的纯化及鉴定（彩图8）。

（一）抗原的纯化与动物免疫

抗原要求是纯度越高效果越好。细胞性抗原取1×10⁷个细胞行腹腔免疫；可溶性抗原需加弗氏完全佐剂并充分乳化，抗原用量一般为100μg。

免疫的动物要求是与骨髓瘤细胞同源的、年龄在8～12周的BALB/c健康小鼠。可同时接种3～5只小鼠，避免免疫反应不佳或动物死亡。免疫方案同抗血清制备。末次免疫后3～5天可分离脾细胞。收集血液、分离提纯血清供测定抗体及滴定用。

（二）骨髓瘤细胞、B细胞及饲养细胞的制备

1.小鼠骨髓瘤细胞的制备　合适的小鼠骨髓瘤细胞应满足下列条件：①小鼠骨髓瘤细胞系来源应与制备脾细胞小鼠是同一品系，这样杂交融合率高；②小鼠骨髓瘤细胞自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子，避免对杂交瘤细胞中的抗体合成基因产生抑制；③能在体外连续培养，生长迅速，繁殖周期短于24h；④小鼠骨髓瘤细胞株是次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（hypoxanthine－guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）缺陷株。目前常用的小鼠骨髓瘤细胞株是SP2/0和NS－1细胞株。选择处于对数生长期、细胞形态和活性都良好的细胞（活性大于95%）作为融合细胞。一般在细胞融合前一天，在新鲜培养基中，调至细胞浓度为2×10⁵/mL，次日即为对数生长期细胞。

2.B细胞获取　因脾脏是B细胞聚集的主要场所，故通常是取经过特异抗原免疫过并产生抗体的动物的脾脏作为B细胞来源。将脾细胞用台盼蓝染色计数，活细胞数应占95%以上。

3.饲养细胞的制备　体外培养条件下，细胞生长依赖适当的细胞密度，所以在培养融合细胞以及细胞克隆化培养时，均需要加入其他饲养细胞。小鼠腹腔巨噬细胞是最常用的饲养细胞，能分泌细胞生长因子，有利于细胞生长，同时可以吞噬衰老的细胞与微生物。另外，小鼠脾细胞、大鼠或豚鼠腹腔细胞等也可用作饲养细胞。小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法为：冷冻果糖液注入腹腔，轻揉腹部几次，吸出腹腔液，其中含有巨噬细胞和其他细胞。

（三）细胞融合

产生杂交瘤细胞的关键环节是细胞融合。目前最常用的细胞融合剂为聚乙二醇（PEG），使用浓度通常为400g/L。PEG可导致细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜容易打开而有助于融合。细胞融合的基本操作是将两种要融合的细胞混合后加入PEG，使细胞彼此融合，融合时间控制在2min以内，然后用培养液稀释PEG，抵消PEG的作用，再将融合细胞适当稀释，置培养板孔中培养。融合过程中应注意以下情况。①细胞比例：瘤细胞与脾细胞的比例可从（1∶2）～（1∶10）不等，常用1∶4；②培养液的成分：优质培养液对融合细胞尤其重要，其中小牛血清含量、各种离子强度及离子种类、温度、pH值及营养成分均会影响细胞融合率，需严格控制。若融合率下降，应检查培养基情况。

（四）杂交瘤细胞的筛选

杂交瘤细胞的筛选是将融合后的细胞混合体接种在HAT选择培养基上，仅有杂交瘤细胞生长，从而实现筛选。原理是肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一是主要合成途径，由糖和氨基酸合成核苷酸，然后合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程；二是替代途径，在次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）及胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化下，利用次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷合成DNA。HAT选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨甲蝶呤（aminopterin，A）与胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），其中氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断主要途径合成DNA。细胞混合体中有脾－骨髓瘤细胞融合的杂交细胞、脾－脾细胞融合细胞、骨－骨髓瘤融合细胞及未融合脾细胞与骨髓瘤细胞。脾细胞（B细胞）可通过旁路合成DNA而生存下来，但在培养基中不能生长繁殖，于5～7天内死亡。骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷株，在HAT培养基中，不仅其合成DNA的主要途径被氨甲蝶呤所阻断，又因缺乏HGPRT而不能利用次黄嘌呤，导致替代途径也不能合成DNA，因此不能在HAT培养液中生长。由脾细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞，同时具有亲代双方的遗传性能，虽然合成DNA主要途径被甲氨蝶呤阻断，但由于杂交瘤细胞可从脾细胞获得HGPRT，能经替代途径合成DNA，因此，只有杂交瘤细胞能在HAT培养基中得以生存而被筛选出来（图6－4）。

图6－4　核酸合成途径及HAT筛选原理示意图

注：－表示阻断。

（五）阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与细胞冻存

一个B细胞识别一种抗原表位，而用于免疫小鼠的抗原可能含有多个抗原表位，因此，在HAT培养液中生长的杂交瘤细胞中，既有针对目的抗原表位的特异性抗体分泌细胞，又有非特异性抗体分泌细胞及无关的细胞融合体，故必须及时筛选检测培养物上清液是否含所需单克隆抗体，从而确定出阳性杂交瘤细胞。然后进行多次单个细胞培养，即克隆化。实验室最常用的克隆化方法是有限稀释法。

有限稀释法是将杂交瘤细胞悬液连续稀释，最终使96孔培养板中每孔的细胞数为一个，培养后取每孔上清液，以ELISA或其他方法检测抗体含量。根据抗体的分泌情况筛选出抗体高分泌孔，对高分泌孔中细胞经反复多次克隆化（至少3～5次）后，可获得较稳定的由单个细胞增殖而形成同源性的杂交瘤细胞克隆。

筛选出的杂交瘤细胞即阳性克隆应及时冻存，以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。目前常用液氮冷冻保存，冻存液为终浓度90%的小牛血清和10%的二甲亚砜（DMSO），每管0.5mL，所含细胞数为1×10⁶～5×10⁶个。细胞置入液氮前，应逐渐降温（即“慢冻”），最后放入－196℃液氮中可长期保存，冻存温度越低越好。冻存的细胞复苏时应立即浸入37～40℃水浴，使之迅速融化（即“快融”），细胞复苏后可作台盼蓝染色计数，活细胞不着色，死亡细胞染成均匀的蓝色。以活细胞数占计数总细胞百分比表示其活力，细胞活力应在50%～95%。同时还应对细胞株进行遗传性能、产抗体能力的鉴定，合格者调整至所需浓度后即可用于生产单克隆抗体。

（六）单克隆抗体的制备

经反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株（及时冻存的细胞除外）应立即扩大培养，并尽早使用这些细胞株制备单克隆抗体。目前，大量制备单克隆抗体的方法有体外培养法和动物体内诱生法两种。

1.体外培养法　将杂交瘤细胞接种到培养瓶中，在5%CO₂、37℃培养数天，当培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液离心去除细胞和碎片。本法所制抗体含量不高，为5～25μg/mL，能满足部分实验要求。另一种是杂交瘤细胞高密度培养，可制备大量单克隆抗体。高密度培养法分两种：一种是悬浮培养系统，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器；另一种是细胞固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养法和微囊化细胞培养法。该法生产工艺简单、易控制，可大规模生产，目前国际上上市的单克隆抗体多采用此种方法制备。

2.动物体内诱生法　选用BALB/c小鼠或其F1代小鼠。首先用医用液体石蜡0.5 mL注入小鼠腹腔，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，接种量为0.5×10⁶～1×10⁶个。接种后1～2周，有明显的腹腔积液产生，分次采集腹腔积液，每只小鼠可收集10～20 mL。将收集的腹腔积液离心去除细胞，灭活（56℃，30min），再离心取上清液即可。此法制备的抗体含量高，每毫升含量为5～20mg。

（七）单克隆抗体的纯化与鉴定

经上述两种方法制备的单克隆抗体，由于其中含有培养基、宿主或克隆细胞本身的一些无关蛋白，必须进一步分离和纯化。方法是：先用半饱和、饱和硫酸铵进行初步沉淀，再用亲和层析法等方法进一步纯化。

纯化后的单克隆抗体需鉴定抗体的效价、特异性、亲和力、Ig的种类与亚类及识别的抗原表位等。鉴定方法有放射免疫测定、ELISA、沉淀试验等，以ELISA方法常用。一般先行定性检测，若阳性，再做定量检测。

三、单克隆抗体的临床应用

单克隆抗体在生物医学领域有着极大的应用价值。

1.应用于临床诊断　作为医学检验试剂，单克隆抗体的特异性强，可避免或减少交叉反应，提高抗原抗体反应结果的可信度。同时由于单抗的高度均一性，使抗原抗体反应结果也具有均一性，有利于检测结果的标准化。目前临床上许多试剂盒都用单抗制成，主要应用如下。①诊断病原体：单克隆抗体应用最多的领域，如诊断乙型肝炎病毒、疱疹病毒、EB病毒及其他病原体感染的试剂。可鉴别菌种型及亚型等。②检测肿瘤抗原：目前用于临床的主要是抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体，如甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体。③检测淋巴细胞的表面标志：淋巴细胞及其亚群在不同的发育阶段表达不同的标志，即不同的分化抗原。利用抗分化抗原的单克隆抗体可区分细胞群、亚群及分化阶段。如用抗CD4单克隆抗体可鉴别CD4^＋T细胞亚群。④测定机体微量成分：结合单克隆抗体和其他免疫技术，可对机体多种微量成分（如酶类、维生素、激素药物、细胞因子等）进行定性和定量检测。

2.应用于临床治疗　将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与放射性核素、化学药物连接，利用单克隆抗体与相应抗原结合的导向作用，将放射性核素、化学药物携带至病变部位，直接杀伤肿瘤细胞，且副作用少。另外，用一些非杀伤性单克隆抗体（如抗CD4、抗CD8等）封闭T细胞表面分子而诱导免疫耐受，可防止移植排斥反应。

3.应用于物质的提纯　制备出被提纯物质的相应单克隆抗体，然后用相应的单克隆抗体作为亲和物的一方，利用亲和层析法提取高纯度的目标物质。