光学显微镜技术

第一节　光学显微镜技术

在细胞学研究中，光学显微镜（light microscopy，简称光镜）技术发挥了重要作用。目前人们将多种现代生物学技术、计算机技术融入光镜技术，使光镜能显示出更细微、更清晰的细胞结构。

一、普通光镜技术

光镜一般由光学部分、机械部分和照明部分组成，其中光学部分最为关键，它由目镜（eyepiece）、物镜（objective lens）组成。普通光镜的最大分辨率为0．2μm。由于动物细胞一般是无色与半透明的，所以样品在观察前要经过染色。不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，这样便能形成足够的反差以区分该种细胞组分。如最常用的染色液苏木精对带负电荷的分子有较强亲和力，因此可揭示出DNA、RNA和酸性蛋白质在细胞中的分布；而伊红和亚甲蓝（美蓝）能特异性地与不同蛋白质结合，从而显示出这些蛋白质在细胞内的分布情况。

二、相差和微分干涉显微镜技术

1932年，德国物理学家Fritz Zernicke研究发现光线在通过生物标本时，除了波长和振幅的变化外，还有相位的差异，只有将这种相位差转变成振幅差时，才能被人眼分辨出来，即相差理论。将这一理论应用于显微镜，从而发明了相差显微镜（phase contrast microscope）。在实验中，常用的是倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope），它的光源和聚光镜装在载物台上方，相差物镜在载物台下方，这样更便于观察培养瓶中的活细胞。

三、荧光显微镜技术

荧光显微镜（fluorescence microscope）是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜，它是研究特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具之一（图1－1）。

图1－1　荧光显微镜原理

将细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光称自发荧光。另一些细胞内成分经紫外线照射后不发荧光，但若用荧光染料进行染色后，就能在荧光显微镜下观察到荧光，这种荧光称为诱发荧光。目前可供选择的荧光染料很多，如（DAPI）联脒基苯吲哚可以染DNA，吖啶橙（acridine orange）可以使DNA、RAN上色，碘化丙啶（propidium iodide）可以使DNA着色，Hoechest33258、Hoechest33342可以将染色体着色。将荧光染料和抗体共价结合，被标记的抗体和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，经激光激发后发射荧光，从而可以观察了解抗原在细胞内的分布。

四、激光共焦点扫描显微镜技术

激光共焦点扫描显微镜（laser scanning confocal microscope）是20世纪80年代出现的一种新型的显微镜，它是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像（图1－2）。这样形成的图像异常清晰，其分辨率比普通荧光显微镜提高1．4～1．7倍。图1－2A显示激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点；B则表示从焦点发射的荧光（样品一般经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像再被检出；C表示通过样品其他部位的激光即激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出所谓共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。

图1－2　激光共焦点扫描显微镜的原理