显微切割技术

显微切割技术是20世纪90年代研发出的一种能够在显微镜直视下从组织切片或细胞图片的任意区域切取分离出数百个、数十个甚至单个细胞的技术。收集的细胞可直接用PCR、SSCP、基因组杂交、DNA测序等分子生物学方法进行检测。该技术特点概括如下。一是“细微”,由于切割在显微状态下进行,采用特殊方法分离、收集样本,切割对象可小到微米级,切割精度可小到毫微米级。利用此技术可分离收集到核仁、包涵体、染色体特定区带这样的微小样本。二是“原位”,显微切割技术是在组织、细胞或染色体的原位取材,所取样本定位明确,实现了从复杂组织多种多样细胞中选取特定细胞用于研究的梦想。三是“同质化”,即可以在复杂组织或多种多样的细胞中从不同部位选取具有相同形态或蛋白表达组织或细胞,从而保证所取样本的共同性“同质化”。四是“结合”,本技术是在病理学,尤其是免疫组织化学等形态学基础上发展起来的一门技术,由于单一细胞中某种分子的含量极少,该技术必须与分子生物学技术,特别是PCR技术结合使用,才能达到研究某一细胞中分子变化的目的。显微切割所获取的样本可用于提取蛋白质、DNA及RNA等,提取物用Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等分子生物学技术检测,然后进行形态学与分子生物学间的相关分析,确定某一特定组织、细胞的特殊功能或生物学行为。因此,该技术在生物医学研究,特别是在病理学为代表的形态学研究中有着广阔的应用空间。该技术最突出的特点是能在构成复杂的组织中获得某一特定形态的单个细胞或细胞群,尤其适用于肿瘤这一具有特殊形态细胞团体的分子生物学研究,如克隆性分析、发生和演进过程各阶段细胞基因及其表达的变化的比较研究、肿瘤细胞内某种蛋白的定量检测等。

用于显微切割的组织切片可以是冷冻切片、石蜡包埋组织切片,也可以是细胞涂片或细胞爬片。切片厚度一般为4~10μm,冷冻切片需用甲醛或乙醇固定。另外,用于显微切割的组织切片都需要染色,以便目标群体细胞或单一细胞的定位。“定位”是显微切割能否成功的关键,如果不能做到“定位”准确,这一技术就没有实施的必要。显微切割前,组织切片除需要用“HE”、甲基绿、瑞氏等常规方法染色定位外,有时还需借助组织化学、组织特染、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、FISH等方法“定位”,以确定待切割组织、细胞,甚至是细胞的某一部分。例如,在研究人乳头状瘤病毒(HPV)对宫颈癌的致病机制时,可以用免疫组织化学或原位杂交方法标记肿瘤及相关组织细胞,选择性显微切割出HPV蛋白或核酸阳性的细胞用于后续检测或研究。显微切割材料种类的选择应依据研究目的和后续研究所用方法而定。回顾性研究中应用最多的是福尔马林固定石蜡包埋组织切片。如切取的样本用于RNA分析,通常要用冷冻组织切片或制备新的细胞片,以确保细胞中RNA不被RNA酶降解。如显微切割后需要进行基因组DNA分析,则应注意保持基因组DNA完整性,避免在样本处理过程中造成DNA断裂或降解,即选择恰当的方法固定、保存样品。例如福尔马林固定石蜡包埋组织过程中DNA容易发生断裂,且随着保存时间的延长DNA断裂增多。因此,当显微切割的样本需要用于DNA分析时,要尽可能选用新鲜组织的冷冻切片,如必须用石蜡包埋组织,也要注意保存时间。石蜡组织切片显微切割样本用于PCR分析时,应注意设计的引物片段不要太长,一般在200bp以下。显微切割分离样本组织、细胞或亚细胞成分量的多少对后续实验结果影响很大,所需样本量的多少也需要依据研究目的及后续实验所用方法而定,同时还要考虑组织类型、固定方式、切片厚度、细胞大小等诸多因素的影响。冷冻切片一般情况至少要取10个细胞,石蜡切片一般要取30个细胞。如分析切割样本的病原微生物DNA状况,则应注意细胞内病原体的DNA拷贝数,拷贝数越少,需要切取的细胞数应该越多。有时在不影响形态观察的前提下,为切取足量的样本,组织切片可适当增加厚度。石蜡包埋组织一般选用7μm的连续切片,以便能从不同的切片上切取到相同的成分。后续研究要进行基因组DNA分析时,一般来说细胞越大,需要切取的细胞应越多,以弥补因对细胞切取不全造成基因组DNA或待检成分丢失造成的损失。从切取细胞提取DNA多采取直接法,即蛋白酶K消化后加热灭活酶的方法,这样能减少在提取过程中DNA的丢失。如用激光捕获显微切割或切取到的细胞较多时,也可用常规酚-氯仿抽提法提取细胞DNA。石蜡包埋组织中的DNA断裂较多,切取这类样本的后续研究如有PCR扩增,扩增片段越长,切取的细胞应越多。

显微切割方法有手工操作法和激光捕获显微切割法两种。前者因操作技术难度很大目前用得较少,后者用的较多,其基本原理为:把组织切片放在倒置显微镜载物台上,并在切片表面覆盖一层乙烯乙酸乙烯酯薄膜(EVA膜),将待切割区域移至显微镜视野中心,让激光束从切片的上方向下垂直照射,使其光路与显微镜聚光器光路共轴,并让光斑恰好落在显微镜视野中心,即待切割区域。然后揭起EVA膜,此时与之黏着的待切割细胞也随之被完好地从切片上切取下来。将带有细胞的EVA膜放入试管,加入蛋白酶消化使细胞与膜分离,并使细胞裂解,从而获得DNA、RNA和蛋白质等待提取物质。最后将提取物质用于相应研究。

激光捕获显微切割是通过激光显微细胞分离系统实现的。该系统由倒置显微镜、红外激光发射器、真空泵、细胞转移膜及计算机系统组成。通过显微镜载物台中真空泵固定载玻片,通过附着在离心管盖底的超薄细胞转移膜将由红外激光切割分离出的细胞移入离心管,并在离心管中被事先放入的提取液直接溶解和提取(提取液要依据样本类型及后续研究实验要求而定)。整个过程无需任何手工操作,实现了无污染的细胞分离。常用的激光显微细胞分离系统的激光光束直径有3个规格,分别为<7.5μm、15μm和30μm,<7.5μm的光束用于切取单个细胞,15μm和30μm的则用于切取较大区域的细胞。分离前后及被切取细胞的图像必须以统一数据库格式储存于计算机。

近年来显微切割技术在分子病理学研究中的应用范围不断扩大,在疾病基因突变检测、疾病特异基因表达分析、杂和性丢失检测、微卫星序列不稳定性分析、新致病基因发现、核酸及蛋白质的定量研究、染色体畸变分析、细胞局部病变病因学研究等多个领域广泛应用,取得了许多该技术诞生前不能想象的研究成果。