相衬显微镜的光学设计

相衬显微镜光学设计的要点是：①分离从样品出射的透射束和衍射束以使它们位于物镜背焦面的不同位置；②然后使透射束移相和减幅来获得像平面上物体和背景之间的最大振幅差。为此，需要两个特殊仪器装置：环形光栏（或称聚光镜环形光栏，condenser annu-lus）和相位板（phase plate）。

图3-5是相衬生物显微镜的光学布置图。图中的环形光栏是一块含有透明圆环的不透明黑圆板，它位于聚光镜前孔径处以使照明光束（在环形光栏下方，图3-5中未画出）透过圆环形成具有暗中心的空心圆锥光束（图3-5中的白色区域）照射样品。在科勒照明条件下，不与样品发生交互作用的透射波被聚焦到物镜的背焦面上形成一个亮环。物镜背焦面是与聚光镜前孔径平面共轭的，所以在物镜背焦面上形成环形光阑圆孔亮环像。而衍射波穿过整个物镜背焦孔径所含的衍射平面（图3-5中的灰色区域），它的光量和位置取决于样品中光散射体的数目、尺寸和折射系数。环形光阑以这样的方式把透射波和衍射波在空间上分离以致可选择操纵它们的相位。

图3-5 相衬生物显微镜的光学布置

为了细微地改变透射光（S波）的相位和振幅，需要一块相位板，如图3-6所示。它被安装在处于或接近物镜的背焦面处（见图3-5）。在某些相衬物镜中，相位板是一块通过浸蚀减厚后所制成的圆环玻璃板，环厚度的减少改变了光程差而使S波的相位提前π／2。因此，从相位板出射的透射束（S波）和衍射束（D波）的光程差为λ／2，相位差为π，如图3-4（a）所示。环处再涂上一层能部分吸收光的金属薄膜，可以降低光的振幅达70%～75%。

图3-6 细微改变相位和振幅的相位板

产生正、负相衬图像的光学图像见图3-4。在图3-4（a）所示的正相衬光学中，从相位板出射的透射束（S波）和衍射束（D波）的光程差为λ／2，相位差为π，即S波和D波是相消干涉（见图1 17），反相位叠加。一般而言，反对相位提前的操纵仍然不能产生高衬度的图像，因为S波的振幅远高于D波。为此，在相位板内圆环上涂上一层半透明金属薄膜，可以降低约70%的S波振幅。由于P=S+D，像平面上的干涉产生一个振幅远小于S波的P波，因此，产生了显著的衬度。图3-4（a）中红血球的折射系数大于周围介质的折射系数，导致通过由红血球所产生的D波相对于S波在相位上被推迟了λ／4光程差，通过在物镜背焦面处的相位板又被推迟了λ／4（见图3-6）后，D波相对于S波最终推迟了λ／2，两者的相位差为π，并且合成的P波振幅远小于周围介质所产生S波的振幅。值得指出的是，红血球的折射系数大于周围介质的折射系数，故红血球产生的衍射（散射）大于周围介质衍射，因此其强度是由透射和衍射所产生的合成波（P波）的振幅所决定的，而周围介质（背景强度）由透射波（S波）的振幅所决定。由此推断，在正相位衬度下呈现红血球暗的衬度。反之，在负相位衬度红血球呈现亮的衬度，如图3-4（b）所示。

如公式（1-8）所示，除折射率的不同影响光程差外，厚度差也影响光程差。在金相显微镜中是利用反射光成像的，基体（凹）比第二相（凸）推迟的光程差Δ为2Δd（见图3-2），因此基体相当于高折射率的红血球，而第二相相当于低折射率的周围介质，因此，在正相位衬度下第二相成像为亮的衬度，而基体呈现暗的衬度，如图3-7（b）所示的钴基铸造合金中的第二相。应该记住：在用透射光成像的生物显微镜中，样品中高折射率（或厚）的区域，在正相位衬度下呈现暗的衬度；而在反射光成像的金相显微镜中，样品中凹区域在正相位衬度下呈现暗的衬度，凸区域呈现亮的衬度。金相显微镜中的衬度与生物显微镜中的衬度是相反的。

图3-7 钴基铸造合金的明场像和相衬图像

（a）明场像；（b）相衬图像

在相衬显微镜所观察的样品中，其高度差在10～150nm可得到较好的相衬图像。若两相高度差大于150nm，这时P波和S波的相位差太大，而已制备好的相环只能使S波提前或推迟π／2，这时经过相位移的S波不能与D波同相位或反相位，叠加后的干涉不明显。当两相的高度小于10nm时，P波和S波的相位差太小，即D衍射波非常弱，S波经调幅后仍远高于D波，叠加后干涉效果也不明显。对一般的相衬显微镜，两相高度差为25nm左右时的图像衬度最佳。