正常组织放射损伤的分子机制

第一节　正常组织放射损伤的分子机制

传统的观点认为正常组织放射损伤仅仅是射线对实质细胞的损伤效应。但随着放射生物学的发展，更多学者认为正常组织放射损伤是一个复杂的病理生理过程，不仅包括相互作用、相互依赖的实质细胞，而且与大量细胞外间质和生物活性分子密切相关。对放射损伤过程的认识将有助于阐明急性或迟发性损伤的临床和病理特征，从而为放疗并发症的预防和治疗提供理论依据。

一、内皮细胞改变和凝血系统激活

凝血系统激活实际上是各种形式创伤性损伤的起始反应。然而很多放射损伤并不直接破坏血管，即使血管在结构上完整无损，但也会产生凝血系统激活。比如，放疗产生的活性氧可以迅速灭活内皮细胞（endothelial cell，EC）表面的血栓调理素（thrombomodulin，TM），这一过程大大促进炎性反应的出现。随后是放射性内皮反应相关物质表达的改变，包括凋亡及黏附分子、组织因子、Ⅷ因子相关抗原（vWf）、环前列腺素、血管收缩素转化酶、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血　烷和TM。放疗还可以持久地下调内皮一氧化氮（NOS）、TM和血纤维蛋白溶酶原激活剂，在EC表面形成持久促凝血。这些过程与其他一些损伤的内皮效应一致，可引发或促进迟发性放射损伤。凝血系统的激活促进丝氨酸蛋白酶和凝血酶的形成，凝血酶在凝血系统中发挥着主要作用，通过去除纤维蛋白原中血纤维蛋白肽A和B，同时激活血小板，最终形成纤维蛋白-血小板凝块。另外，凝血酶在细胞增殖、炎性反应和组织修复中也有重要的调节作用，如调节内皮通透性、中性粒细胞和单核细胞的趋化性，以及TGF－β1的产生等等，这些作用机制与凝血系统并不相关。无论在体外或体内特异性的抑制凝血酶将降低平滑肌细胞的增殖、迁移和胶原生成。凝血酶的非凝血效应是通过激活蛋白酶体活化受体（PAR）家族相关受体起作用，其中PAR－1研究得最清楚，可能与放射生物学密切相关。放疗对EC的一些主要非致死性损伤概括如表2－1。

表2－1　放射对内皮细胞直接非致死性损伤

二、炎症反应

1.直接炎症反应　放射诱导炎症反应常来源于直接非致死性的放射损伤。比如人类相对小剂量放射暴露后大约数小时即可出现血管扩张，肉眼常常无法察觉，通过仪器可以检测到，通常称为早期皮肤红斑反应，其损伤的程度有种族差异。放疗导致血管扩张和渗透性增加的机制已经很明确，包括放疗直接损伤肥大细胞和内皮细胞组织胺释放前列腺素I₂和E₂（PGI₂和PGE₂），放射暴露后数小时，中性粒细胞黏附到内皮表面，易化了这一过程。同时一连串补体和激肽的激活也进一步刺激此炎症过程。例如眼镜蛇毒素因子有消耗补体作用，从而可以抑制血管通透性的增加和随后的皮肤纤维化。物理性创伤后，首先激活促炎因子，然后合成应激敏感激酶和转录因子，继而触发急性炎症反应，比如TNF－α、IL－1、IL－8和IFN－γ，随后又阻止炎症反应，缩短促炎因子半衰期和产生抗炎因子，比如IL－4、IL－10、IL－13和TGF－β，但炎症并不可能完全得到控制。另外，放射损伤激活异常的细胞因子通路或者一些细胞因子的长期过剩，最终导致不可控制的细胞基质集聚和纤维化。

放疗过程中，单次放疗的炎性反应并不可能在24h内消失，因此就导致了放射损伤的积累。此外白细胞黏附相关过程呈剂量和剂量率依赖性。Molla等发现在总剂量相同情况下，高剂量率照射的大鼠P选择素和细胞间黏附分子－1（ICAM－1）的表达高于中等剂量率照射的大鼠。Ross等报道高剂量率照射IL－1β和IL－6mRNAs表达增高，而低剂量率照射其表达并不增加。Hallahan等证实低剂量（＜2Gy）照射后细胞黏附分子E选择素表达增加，促进中性细胞黏附，而ICAM－1却在高剂量（＞5Gy）照射后才会增加。上皮表面的红斑反应多源于致死性、功能性和间接细胞损伤引起的炎症反应。光学显微镜下人类组织急性放射损伤表现为中性粒细胞附壁和外周血管渗透性增加。放射诱导的EC凋亡可以增加微血管血栓形成，白细胞趋化到损伤的部位、EC黏附并移居组织，然后释放蛋白水解酶和各种活性氧，血管通透性增加和扩张还可能源于其他的细胞坏死、凋亡和继之的各细胞层炎症反应。放疗性炎症反应提高了细胞因子（cytokines）和生长因子的水平，如TGF－β，进一步放大了内皮细胞功能紊乱、延迟内皮细胞再增殖的过程，从而使放射损伤进一步恶化。

我们注意到每次放疗后血管扩张和渗透性的消退速度与临床表现密切相关。单次大剂量放疗后需要数小时或者数天才能观察到损伤消退，而并不是亚致死性放射损伤修复的时间。放疗过程中血管扩张和渗透性增加的累加是一个复杂的问题。每天2Gy放疗，分光光度测定法测得人类皮肤红斑基本与放疗累积剂量平行。然而放疗的第2周或第3周后出现机制不明的血管收缩对抗血管舒张，也说明累积效应并不是以恒定的速率进行。重要的是无论单次剂量低于还是高于2Gy，测得的最大红斑效应都显著超过线形LQ方程预测的水平。因此，剂量累积速率（rate of dose accumulation，RDA）对放射性炎症和微血管损伤具有显著的决定性作用。目前分割剂量和总治疗时间对炎症反应影响的实验研究较少，Hauer－Jensen等的肠放射损伤研究证实两者都很重要，总治疗时间不变分割剂量加倍，在放疗的第2天和第26天其TGF－β表达显著增加；然而分割剂量不变总治疗时间减半，TGF－β增加更加显著，但放射损伤的组织学评分并没有同时发生相应改变。

2.抑制炎症反应　Trott和Kamprad综述了放疗促进和抑制炎症反应的效应，但促进和抑制炎症反应主要依赖于剂量和治疗方案。抑制炎症效应常出现在低剂量照射，高剂量照射可通过诱发炎症反应产生抗肿瘤作用，但同时也抑制正常组织损伤的修复过程。但目前仍不完全清楚具体什么情况下完全上调或下调炎症反应，比如放疗抑制炎症浸润效应，可能是放疗降低了巨噬细胞活性和抑制损伤基质修复，但是炎症反应的白细胞浸润是来源于循环系统，局部放疗其可以源源不断得到补充，因此限制了对炎症反应的抑制作用。有趣的是最近的研究发现放射性炎性粒细胞浸润含有“纤维细胞”，可表达Ⅰ型胶原、细胞因子和趋化因子，这些因子是炎性反应进展必须的。此外，放疗杀死了流经放射区域的淋巴细胞，局部放疗第1周淋巴细胞减少。在急性炎症反应、修复过程及各种慢性炎症反应中，淋巴细胞发挥着重要作用。放疗后淋巴细胞减少，对上述这些反应过程的影响还有待进一步研究。

三、放疗对上皮细胞的直接影响

1.上皮损伤和再群体化　放疗上皮再群体化开始于生长阻滞起始阶段，人类大约在2Gy照射后7d，但触发加速再群体化机制仍然没有完全搞清楚，Trott和Kummermehr认为上皮细胞密度减低至极限约60%时，触发加速再群体化。大鼠皮肤黏结蛋白－43（connexin 43）可能在这些组织的再群体化过程中发挥作用，其表达随角化细胞密度的降低而变化。临床放疗损伤诱导细胞再群体化的研究表明:上消化道黏膜有很强的再生能力，2Gy/d照射，1/3的患者再群体化过程能抵消细胞杀伤作用。放疗显著提高细胞增殖的机制仍然不明确。Dorr认为放疗解除了正常受限制“休眠”的干细胞组分，使其转化成细胞生长分裂必需的活跃干细胞组分。放疗期间调节细胞持续增殖的机制也仍需要进一步研究，大鼠舌放疗后上调了细胞增殖过程，可以有效抵消放疗损伤所致的持续细胞削减。Hovdenak等对放疗后人类直肠黏膜活检结果似乎也显示黏膜协调有序的增殖可以起到屏障保护作用，但其作用也是有限，若剂量积累速率超出常规分割2Gy/d，10Gy/周，大量的活体黏膜上皮细胞坏死，当被杀伤速率超出了组织重建所需细胞再分布补充的最大速率时，将导致细胞削减诱发早期严重的临床症状。如果放疗细胞耗损或屏障功能紊乱太严重，那么炎症反应增加会进一步延长上皮细胞脱落时间，阻止修复过程。对大鼠肠道黏膜进行加速放疗的临床前期实验［2.8Gy/（次/d）与2.8Gy/2（次/d）或2.8Gy/3（次/d）比较］研究取得了与此一致的结果。

2.放疗对上皮细胞基膜结构（BMZ）和屏障功能损伤 BMZ的破坏会延迟表皮细胞再生，因而影响正常表皮的屏障功能，甚至损伤皮下结构并形成炎性反应引起损伤加重，最终导致炎症和纤维化，表皮伴有溃疡的急性损伤很难完全愈合而易转化成慢性，Peters在文章中称之为“consequential”损伤。然而也有数据显示急性损伤后的“consequential”损伤并不会导致上皮显著不愈合。“consequential”损伤上限和下限仍然没有明确界定，但很明确的是上皮基膜的破坏和上皮细胞屏障功能障碍将会显著提高其危险性。Trans－tasman放疗协作组头颈部临床实验显示:短时间的破坏基膜和上皮细胞屏障引起晚期黏膜反应。在实验中比较了70Gy［2Gy/（次/d）连续35次/7周］和59.4Gy［1.8Gy/2（次/d）连续33次/3.5周］，因为常规方案剂量高，预计要经历比较严重的晚期黏膜反应，这一预期在短期急性炎性反应中得到证实，但两个治疗方案之间长期急性炎性反应并没有显著差异，这就暗示在加速治疗引起晚期效应时还有其他方面的机制，Hauer－Jensen指出外科或药物性阻断胰腺分泌可以减低早期或晚期回肠放射性损伤，这为黏膜屏障作用重要性提供了直接证据。

急性炎症反应常不会引起上皮剥落，一定程度上可激活一系列生理反应而导致晚期损伤。在上面的肠损伤模型中，经历轻微急性上皮炎症反应的晚期损伤同样对治疗分割不敏感，但对治疗时间有很强的依赖性。此外，若基膜完整发生急性期反应则导致“consequential”损伤。Bentzen和Overgaard注意到放疗后发生湿性蜕皮的乳腺癌患者，皮肤毛细血管扩张的比率在增加。Turesson证实了这一观察结果，但严重红斑反应，即使没有湿性蜕皮，患者皮肤毛细血管扩张的比率也在增加。

四、放疗对细胞间质的损伤

高剂量放疗会钝化急性创伤后肉芽组织形成反应。首先，创伤后大范围组织破坏、出血、缺氧和细菌浸润，会促进创伤后肉芽组织形成，而放疗是否会促进肉芽组织形成还缺乏足够的证据。此外，放疗阻止纤维和血管形成，并呈剂量和分次依赖性。毫无疑问，放疗抑制肉芽组织形成与外科手术后伤口愈合密切相关，这是我们在设计放疗和外科联合治疗方案时要考虑的重要方面。在急性放射损伤的病理组织中我们很少看到正常的肉芽组织，而在迟发性上皮溃疡中偶尔可以发现。在人类创伤后5d内早期损伤的间质特别脆弱，这期间放疗会明显提高伤口愈合并发症的风险。然而在小鼠、豚鼠的实验及相关临床研究均显示创伤后7d或更长的时间接受放疗，对伤口愈合几乎没有影响。创伤前放疗会削减纤维原细胞的数量，同样也对伤口愈合产生重要的负面影响。无论是手术前1h或95d给予模型大鼠18Gy照射，对术后伤口愈合都会产生破坏性作用，增加分次可以减轻其影响。术前即刻予以单次10Gy的照射，将会危及术后伤口的愈合，但是合理的分次放疗，如40～50 Gy/4～6周却可以避免对损伤间质的愈合影响。体外实验表明EC和SMC同样敏感，且放疗抑制EC增殖。在体内，放疗诱导EC细胞凋亡，抑制正常组织的血管新生。Archambeau等发现毛细血管EC对放疗敏感且呈剂量依赖。单次大剂量照射后上皮细胞再生仅数天，细胞结构急剧下降，这可能与血管内径扩张和腔内闭塞有关；然而常规分割照射微血管变化发生在照射后6周以后，显然就此类型损伤而言分次和（或）RAD尤为重要。

Archambeau发现放疗后没有微脉管内皮细胞增殖证据，Doyle将大鼠上腹部表皮血管蒂植入后0h和24h分别予以3Gy照射，对新生血管形成几乎没有影响，但第3次照射后则有了显著影响，此模型为放疗对新生血管形成过程影响提供了直接的数据。随后剂量提高到30Gy，早期抑制效应增加有限。有趣的是在植入前3d予以3Gy照射并不显著抑制血管新生。

五、迟发性放射损伤

迟发性或者慢性放射损伤的机制可能由于上皮细胞的削减和基质细胞修复过程紊乱，因此放疗损伤作用并不完全基于细胞削减。事实上放疗后内皮细胞和纤维原细胞非致死性损伤会持续到早期正常组织反应恢复后很长一段时间。此外，上皮表面照射后正常的屏障功能的损伤也会对上皮下的炎症反应和纤维化产生影响。在放射性纤维化的发病机制中“放射修复”和“放射反应”过程各自的作用仍然不确定。放射修复性纤维化常常是对实质细胞丢失的反应，无疑在很多情况下与放射性纤维化有关，但目前仍然没完全搞清楚参与这一过程中的一系列很多分子事件。Fajardo多次指出在人类放射性纤维化中缺少显著的炎性浸润，“放射反应”过程在放疗后纤维化发展中发挥着重要作用，上皮屏障作用的破坏是其重要特点，且常伴有持续的不同程度慢性炎症反应。

Bentzen和Overgaard通过大量临床证据发现乳房切除术后放疗有毛细血管扩张和皮下纤维化分离的现象。这就显示两者的发病机制并不相同，其过程并非来源于同一发病基础。毛细血管扩张在急性放射性损伤中很常见且伴有BMZ和上皮屏障功能的破坏，Turesson和Thames发现人类皮肤放射性毛细血管扩张呈治疗时间依赖性，这些观察显示放射性毛细血管扩张发展过程中，急性损伤期间炎性反应损害微脉管系统发挥着重要作用。这些机制与正常组织修复抑制密切相关，在放疗后纤维化过程中作用有限。

目前仍没有完全搞清楚放射诱导非致死性细胞损伤的确切性质及其在体内对迟发性正常组织损伤的作用。关于非致死性细胞影响对迟发性放射损伤的作用机制概括为下列10项（表2－2）。

表2－2　放射性纤维化的机制

1.内皮细胞　晚期放射损伤的特征性改变是出现血管硬化症。血管在经受严重照射后显微镜下可以辨别不同程度的迟发改变，放疗后毛细血管网更容易受到影响。后来的研究中发现EC细胞质的膨胀导致毛细血管腔的破损、局部增生的内皮细胞分离、血栓症、毛细血管壁破裂和整个毛细血管缺失。毛细血管扩张是常见的晚期表现，主要是由于近端和远端平滑肌细胞缺失导致毛细血管压力控制紊乱或者是周围细胞外基质改变。ECs的缺失也可以引起毛细血管扩张，表现为在老膜上覆盖一层新的洋葱皮样新基膜，细小动脉损伤最常被观察到，内皮下和动脉外膜部分或完全被“玻璃样”非细胞嗜酸性物质所取代。中动脉内膜纤维化是很常见放射损伤，将导致不同程度的同中心或偏中心腔内狭窄。纤维斑块常发生在放射治疗区域的节段，并伴有不同程度的中膜和外膜纤维化。几乎所有放射损伤病理中都出现载满“泡沫细胞”的脂肪内膜。

Law最早把血管硬化和放射性纤维化与内皮细胞损伤联系起来。后来的研究提供了充分的证据支持他的观点，认为高剂量放射损伤时除了诱导凋亡，还导致长期内皮细胞表型改变，这些改变引起或至少参与进一步的病理改变。放疗诱导促凝血和促炎性的环境，这些改变不仅促进血液凝结和白细胞动员，而且会过量的诱导受体介导的细胞反应。比如，凝血酶通过激活各种类型细胞蛋白酶激活受体，有力地上调黏附分子和趋化因子的表达、提高炎性和纤维源性细胞因子，以及生长因子的产生包括TGF－β、提高纤维原细胞和平滑肌细胞增殖、促进纤维炎细胞介导的胶原质网格浓度和胶原质的表达。

血管分支常是不均匀的，放射EC功能障碍的性质和结果在不同大小和部位的血管可能不一样。除了一些凝血剂、促有丝分裂、促炎症反应及局部产生的凝血酶的促纤维化作用，循环中的血管活性物质和潜在毒性分子，比如血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和低密度脂蛋白-胆固醇也对血管壁损伤和组织间隙纤维化产生影响。实际上述提到的泡沫细胞仅仅出现在高胆固醇血症时。很多细胞株AngⅡ上调TGF－β2受体，这是血管硬化和组织间隙纤维化中重要的机制。

放射治疗很显然危及脉管系统，虽然很多年来一直认为这将导致各种组织的放射损伤，但现在仍然不清楚组织缺氧是放射损伤的原因还是结果。Hopewell等引用了各种研究结果认为大鼠脑和猪皮萎缩、纤维化和坏死超前于血管损伤，但组织缺血损伤除了在纵隔放射治疗时增加心肌梗死的危险外，在人类其他损伤中是有限的。Vujaskovic等最近的研究提出放射诱导的组织缺氧在永久的迟发性放射性肺炎中发挥重要作用。

2.纤维原细胞和肌纤维母细胞　放疗过程中发生的基质损伤修复和慢性炎症的现象常常称其为反应性纤维化。凝血酶和活化的巨噬细胞等因素通过恢复、转化和刺激纤维原细胞、肌纤维母细胞和平滑肌细胞间接促进胶原质和其他间质成分的沉积。另外，高剂量放疗会直接永久性损伤组织修复中的纤维原细胞和其他细胞。明显局部纤维原细胞亚致死损伤可以通过注射同源性的纤维原细胞到放疗部位使损伤组织恢复正常，这一实验发现在后来临床研究中得到了确认。皮肤纤维原细胞放疗后18年其生长率仍低于未放疗对照区域。有些患者放疗后伴有皮肤长期放射性纤维化后遗症，Rudolph对这些患者皮肤活组织检查的超微结构改变进行了研究，发现放射损伤出、凝血和血管密度正常，然而大部分纤维原细胞表现为超微结构改变，提示这些细胞持续放射诱导基因结构异常可能和纤维化的机制有关，因此呈现出肌纤维母细胞的表型，然而这些肌纤维母细胞并不过量表达TGF－β或组织抑制性金属蛋白酶，它们的寿命比较短，刺激后生长抑制、过氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力低于正常的纤维原细胞。除皮肤以外，肌纤维母细胞在很多其他的放射组织中也可以发现，尤其是大量胶原沉积的地方。与创伤性损伤一样，肌纤维母细胞表达TGF－β、胶原、PAR－1和PAR－2，这些因子在纤维化机制中与凝血酶和肥大细胞蛋白酶发挥协同作用。

有些部位纤维原细胞出现功能障碍或者耗竭，甚至危及到此区域的创伤愈合，但令人迷惑不解的是这些部位放疗后仍可出现显著的放射性纤维化。Rodemann和Bamberg提出受照射组织TGF－β1过度表达，TGF－β1通过扩张原始纤维原细胞池诱导纤维原细胞增殖，还可以诱导原始成纤维细胞早期分化有丝分裂成后期纤维细胞。这些纤维细胞与原始的成纤维细胞相比可以产生更多的细胞外基质组分。如果像他们描述的那样有丝分裂后期纤维原细胞和肌纤维母细胞仍保留产生大量胶原的能力，将有助于解释其即使对新的创伤不能形成增殖反应情况下仍能产生修复性纤维化。

放射性纤维化可以看成是对持续结缔组织沉积信号一种反应性损伤和（或）正常终止纤维化过程下调功能的缺失。Martin等的猪模型可以让我们更深刻地认识这一过程，他们模型中用单次大剂量照射，造成皮肤放射性坏死性溃疡。在这个模型的研究中发现存在两个截然不同的纤维化“组分”。外周“组分”分布在纤维块的外周，包括巨噬细胞和中性粒细胞炎性浸润、肌动蛋白阳性的纤维原细胞并且没有新生血管。此组分的细胞基质富含Ⅲ型胶原质和纤维粘连蛋白。另一是中央“组分”，缺少活力、富含血管、细胞较少都是形态学上正常的纤维原细胞。中央“组分”的细胞基质包括成熟胶原质（I型）和硫酸蛋白聚糖、乙酰肝素和硫酸肤质素。然而模型在人类的实用性方面还是有争议的。但一致性结论认为纤维化过程中存在长期多细胞类型和多步骤的过程。

3.TGF－β和肥大细胞　诸多证据表明很多器官的放射性纤维化与TGF－β有密切关系。TGF－β1刺激间叶细胞增殖和胶原产生，抑制上皮细胞的增殖。TGF－β1还通过抑制T细胞、B细胞和自然杀伤细胞增殖及功能和EC表面核细胞趋化激活因子（MCP－1）和TNF－α受体Ⅱ而表现为显著的免疫抑制。TGF－β对肥大细胞来说是很强的趋化因子，观察数据表明这可能与放射性纤维化机制密切相关。放射性纤维化常伴有肥大细胞增生、短暂的TGF－β过度表达，并且在放射性肺炎和放射性肠病模型中得到证实。在体内放射性纤维化过程中肥大细胞相关介质大部分还没搞清楚。激活的肥大细胞释放组胺、TGF－β、纤维原细胞生长因子（FGF）、IL－4、TNF－α刺激纤维原细胞和胶原形成。肝磷脂、糜酶产生的血管紧张素Ⅱ、糜酶激活的PAR－2和其他机制都直接或间接地与放射性纤维化有关。Hauer－Jensen研究组提供了直接证据证明肥大细胞和TGF－β参与肠放射性纤维化形成。他们的研究也提供了放射性纤维化发展过程中肥大细胞和TGF－β的相互作用。肥大细胞缺乏的大鼠与肥大细胞完整同窝大鼠相比其肠放射性纤维化明显削弱，而这两类大鼠TGF－β表达水平相似。相反，用TGF－βⅡ型受体融合蛋白抑制活性的TGF－β，可以显著地削弱肠放射性纤维化，但却不影响肥大细胞增生的水平。

（杜世锁）