精子检测方法的评价和选择

二、 精子检测方法的评价和选择

作者所做的精液分析全部采用在显微镜下手工操作方法完成。虽然应用计算机分析系统做精子活力分析避免了人工操作的主观性，且比人工操作更稳定可靠，并且增加了精子活力方面的相关参数，但使用精子计算机分析系统也存在以下几个方面的问题：①因为精子计算机分析系统在精子密度低（<20×10⁶/ml）时和精子密度很高（>300×10⁶/ml）时无法完成计数，也可以说应用精子计算机分析系统只能测定正常密度范围的精子；②与测定精子密度一样，在精子密度过低或过高时无法测定精子活力；③ 无活力精子或D级精子不等于死精子，所以做精子活率测定需要做精子活体染色而不能用精子计算机分析系统所测定的D级精子代替；④ 即使有计算机精子分析应用软件，做精子形态学分析也要做精子染色、在操作时也需要人工在显微镜下一个精子一个精子的辨认。

对30例生育组精液进行检测分析，并在近年来本实验室采用技术方法统一、且资料比较完整的1303例患者精液检测结果进行统计分析，两组在精子活率（%）、精子活力（%）（包括A级精子和A+B级精子）、精子密度（×10⁶/ml）、正常形态精子（%）（精子畸形率）和精液细胞学等项指标进行对照分析。

1. 精子活率测定　取10µl混匀精液，加等量（1小滴）0.5%伊红水溶液，混匀，加24×24mm盖片，放1分钟后，置光镜高倍镜下，可见有活力精子头部全部为不着色精子，这就是活精子的拒染现象，无活力精子中头部不着色精子也为活精子，头部染色成红色的精子为死精子。在光镜高倍镜下，调好光源强度，选择精子分布均匀部位，计数100个精子为精子活率（%）。在精子活力不好或D级精子很高时，需要区分出无活力精子是活精子还是死精子，做精子活体染色测定精子活率就显得尤为重要，表2-5为生育组和门诊病例组精子活体染色和无活力（未经染色）精子的对照观察结果，从该表中可看出，活体染色所测定的死精子与无活力精子（D级精子）在生育组和门诊病例组中均具有非常显著差异。

表2-5　30例生育组和1252例门诊病例组死精子（活体染色）和无活力精子（D级）对照分析

2. 精子活力测定　本实验室采用Macro精子计数板（南京源程科技公司生产）法测定精子活力。方法：将混匀精液一小滴（约10µl）滴于Macro精子计数载物平台上，加盖板，于相差高倍镜下，沿Macro计数池横向或竖向按照精子四级活力分级法，用实验室常用的血球分类计数器，左手示指、中指、无名指和小指按照精子A、B、C、D分级分别按在血球计数器的四个按键上，计数100个精子。

优点：① Macro精子计数池高度为10µm，可限制精子在镜下呈同一高度层面上游动，以保证计数的重复性和稳定性；② 在相差高倍镜下计数精子活力比在普通高倍镜下更易清晰地分辨出卷尾精子与无头精子、不动精子与微动精子。

注意：① 不可使用血球计数板计数精子活力，因为血球计数板高度为100µm，会使精子呈上下多个层面，稍微放置就会使不动精子下沉，而使精子活力分级发生偏差；② 如在载物片上做精子活力测定，应该取10µm左右混匀精液，加24×24mm盖玻片，以使精液保证在一个计数层面上而利于精子活力测定。

3. 精子密度测定　精子密度测定采用Macro精子计数法。方法：取混匀后精液0.2 ～ 0.5ml置于56℃水浴灭活5 ～ 10分钟使其制动，再取一小滴（约10µl）混匀精液滴于Macro载物平台上，加盖板，计数10个小方格内的精子数，即为×10⁶/ml精子密度；如精子数量少，可计数Macro计数板中所有100个小格的精子数/10，即为×10⁶/ml精子密度。

对于精子密度较低和精子活力较低的标本，无需灭活而直接将精液加在Macro计数板上计数，通常不影响结果；对经验丰富人员，也可用未灭活精液直接加在Macro计数板上计数（如同精子活力测定），可能会有一定误差，但不会有大的影响。

优点：Macro精子计数法最适用于不液化精液的精子计数。既往在用血球计数板法将不液化精液加入稀释液时，可看到悬浮于稀释液中成条索状的不液化精液，此现象很难使精子均匀地分布于稀释液中，因此会使精子计数的准确性大打折扣；再因为黏稠的不液化精液，而使操作者无法准确吸取所要求的精液体积而使精子计数受到严重影响，用Macro精子计数板法无需做精液稀释，也无需准确加入精液量，即可很好地解决不液化精液的精子准确计数问题。

注意：当Macro精子计数池中出现气泡时会影响精子计数和精子活力测定，此时不可转动计数池盖板而将气泡挤出，这样会使精子分布不均匀（常使精子密度降低），而应该将精液冲掉，重新加样计数。

4. 正常形态精子（精子畸形率）　精子形态学检查必须要采用精液干涂片染色后在光镜油镜下进行正常形态精子和畸形精子分类。作者认为，那些采用精液湿涂片在高倍镜下进行正常与畸形精子分类方法，可以分辨出大头精子、折颈精子、卷尾和双尾精子，但绝对分辨不出小头精子、小顶体精子、无顶体精子和头核固缩精子，而这一组畸形精子是畸形精子中最常见和最重要的。

WHO《手册》推荐用巴氏染色或改良巴氏染色法，本实验室采用改良瑞—姬氏染色法，所谓的改良，是在染色操作方法上不同于传统的瑞—姬氏染色（见精子染色章）。

改良瑞—姬氏染色的优点：① 从本书中各种精子形态图片就可看出，改良瑞—姬氏染色较改良巴氏染色更清晰、细腻和漂亮；② 染色方法操作省时、简单，标本可长期保存（可保存10年以上）；③ 染色后的标本可进行精液细胞学检查、精液中的阴道毛滴虫，前列腺液的细胞和细菌染色，阴道分泌物中的细胞、细菌、阴道滴虫、白色念珠菌和线索细胞等检查。

5. 精液细胞学检查　精液细胞学检查是精液常规分析的非常重要部分。在国内能够做精液细胞学分析的人员和实验室很有限，其中细胞学染色就存在很大的问题。WHO所推荐的改良巴氏染色只用于精子形态学分析，而对于精液中的中性粒细胞推荐采用正甲苯胺过氧化物酶染色。作者采用的改良瑞-姬氏染色可在同张精液涂片、同一次染色，同时对精子和精液细胞等进行形态学分析，而对精液细胞染色比精子染色效果更好，可分析精液中正常脱落的生精细胞，也可分析凋亡生精细胞、胀亡生精细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、支持细胞等精液细胞，也可以说非常简便、好用。