分子生物学基础

时间：2022-05-01 理论教育版权反馈

【摘要】：有关卵巢疾病的分子生物学基础研究大多涉及卵巢癌领域，其典型生物学特征是细胞的异常增殖与低分化，以核酸和蛋白质等生物大分子结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象。通过基因治疗即把正常基因或重组治疗基因经分子生物学技术手段转入异常细胞的DNA系统中，以抑制致病基因表达或修复缺陷基因表达，起到治疗作用。

分子生物学是从分子水平研究生命的本质，是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。有关卵巢疾病的分子生物学基础研究大多涉及卵巢癌领域，其典型生物学特征是细胞的异常增殖与低分化，以核酸和蛋白质等生物大分子结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象。

一、卵巢癌的分子生物学特征

（一）DNA含量

在上皮性卵巢肿瘤中，约有2/3 DNA含量为非整倍体，其中卵巢交界性肿瘤占5%～12.5%。研究上皮性卵巢癌及卵巢交界性肿瘤中DNA含量与患者预后的关系，发现二倍体患者生存期较非整倍体患者明显延长，复发率低，生存率高。因此，非整倍体的出现不仅是上皮性卵巢癌及交界性肿瘤发生的分子基础，而且是患者预后不良的临床指标。

（二）癌基因与抑癌基因异常

目前已知癌基因与抑癌基因表达的适量产物常是维持细胞正常增殖与分化的必要条件，癌基因与抑癌基因表达与调控失衡，可引起肿瘤细胞增殖与分化的异常，在癌基因、抑癌基因异常与卵巢肿瘤病理学类型、组织学分级、手术分期、化疗敏感性、复发等方面的临床研究进展尤为引人注目。

1.bcl-2 在晚期卵巢癌患者中，bcl-2阳性率为42%。bcl-2表达水平与化疗效果成负相关，bcl-2表达、术后残留灶大小及病理学类型是独立的预后因素，特别是bcl-2可能成为晚期卵巢癌患者估计化疗效果及预后的参考指标。特别是卵巢浆液性及子宫内膜样癌。在Ⅲ～Ⅳ期卵巢浆液性或子宫内膜样癌患者中，bcl-2阳性者的预后较阴性者差。

2.VEGF 卵巢癌与血管生成可能与肿瘤转移及复发有关。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤生长的一种重要调节因子，在血管调控因子中，VEGF作用最强、特异性最高，而且与肿瘤生长的关系最密切。flt-1及KDR/flk-1是评价血管增生程度较好的监测指标。VEGF通过与其受体flt-1及KDR/flk-1结合而发挥其生物学功能。在卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤中KDR表达上调，KDR具有维持正常组织血管内皮的完整性及通透性的作用。因此，推测KDR在上皮性卵巢癌中的表达可能与肿瘤发生及转移有关。

3.细胞凋亡 FAS（Apo-1/CD95）是一种相对分子量为48 000的跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子（TNF/NGF）受体超家族。mFas阳性的敏感态细胞在被Fas天然配体（Fas L）或抗Fas特异性单抗激活后迅速凋亡，mFas可在各种正常组织、不同血液细胞以及不同组织类型肿瘤细胞中表达。因此，Fas可视为一种介导凋亡信号的受体。sFas是Fas mRNA发生变异剪接（alternative splicing）后编译的蛋白质产物。sFas在体内竞争性地与表达在免疫效应细胞上的FasL结合，干扰FasL与mFas阳性细胞的结合，从而导致“凋亡缺损”，使肿瘤细胞逃逸机体通过Fas系统途径的免疫清除机制，成为肿瘤产生、存活及进展的重要潜在生物学因素。在多种类型恶性肿瘤中证实，Fas及其配体Fas L表达改变是肿瘤细胞逃避宿主免疫系统监视及攻击的一种重要机制。

4.雌激素卵巢癌是一种激素依赖性肿瘤，目前认为雌激素、孕激素水平异常及其相应受体表达水平改变在卵巢癌的发生与进展、转移与复发、疗效与预后等临床生物学特征中有重要意义，虽然对雌激素及孕激素在卵巢癌发生中的确切机制还不十分清楚。Misao等曾对性激素结合球蛋白（SHBG）野生型及第7外显子剪接变异型mRNAs在妇科肿瘤继发转移部位中表达的意义进行研究，结果发现，在肿瘤原发灶中，60%卵巢癌中SHBG变异型mRNA较野生型SHBG m RNA表达增高。因此，推测SHBG m RNA转录表达水平及其剪接方式的调节可能会改变肿瘤细胞的转移能力，其机制可能与转移灶激素依赖程度改变有关。

5.其他错配修复酶缺乏可引起微卫星及基因组编码区突变率增加，并可能与多种肿瘤发生及耐药有关。卵巢癌微卫星不稳定发生率为26%。NO能增加血管壁的通透性及血流量，一氧化氮合酶（NOS）表达增高能促进肿瘤细胞生长。有研究发现，NOS I在卵巢癌中表达率为58%，特别是在卵巢浆液性肿瘤中，其表达率高于黏液性肿瘤；NOSⅡ在90%以上有表达；NOSⅢ在卵巢癌中表达率为25%。

6.叶酸受体α（FR-α）在卵巢癌中常有异常表达，在卵巢生殖上皮恶性转化过程中，常伴有FR-α表达减低，特别是卵巢黏液性腺癌，常较浆液性下降明显。提示FR-α表达调节方式异常可能参与卵巢癌的形成，对辅助诊断有一定价值，并有可能成为治疗的目标。

二、卵巢癌的基因治疗

卵巢肿瘤由于缺乏有效的早期诊断方法，且手术和放疗、化疗疗效不佳，卵巢癌患者的5年生存率仍较低，成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的恶性疾病。基因治疗与免疫治疗是生物治疗的主要内容，应用于卵巢癌的临床前实验研究已取得较大进展，成为继手术、化疗、放疗之后的一种全新的治疗模式，基因治疗正在成为肿瘤治疗的重要辅助手段之一，并逐渐显示出该方法独特的优越性。

（一）基因治疗机制

肿瘤的发生是多因素、多步骤过程，卵巢癌的发生亦是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果。通过基因治疗即把正常基因或重组治疗基因经分子生物学技术手段转入异常细胞的DNA系统中，以抑制致病基因表达或修复缺陷基因表达，起到治疗作用。

（二）靶向基因治疗的载体

获得具有良好靶向性、安全性和有效性的载体是实现肿瘤基因治疗的关键。目前，常用的载体主要为病毒载体和非病毒载体两大类。

1.病毒载体目前大部分基因治疗采用病毒载体介导，主要有反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体等。反转录病毒载体基因表达稳定持久，但只可转染分裂期细胞，病毒DNA整合进入宿主细胞基因组中，可诱发基因突变。慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒21（HIV-21）演变而来的一种RNA病毒，病毒基因组中有核苷酸定位信号序列，能高效感染靶细胞并使外源基因稳定表达。腺病毒载体感染细胞时DNA不整合到宿主基因组中，不会引起插入突变，安全性高；腺病毒载体外源基因容量大，感染范围广泛，可感染分裂期或静息期细胞，能同时表达多个基因且病毒滴定浓度高，但其靶向性差。

2.非病毒载体是指应用阳离子聚合物来凝集可形成微粒的重组质粒或反义寡核苷酸，从而被靶细胞内吞，起到介导作用，主要有多聚物（聚乙烯亚胺）、阳离子脂质体、裸露DNA和壳聚糖载体系统等。Shahzad等研究发现，重组高密度脂蛋白（r HDL）纳米微粒能够在体内高效转导siRNA。在小鼠卵巢癌和结直肠癌模型中，r HDL纳米粒能够高效地沉默肿瘤生长和转移过程中两种关键性蛋白分子。目前，非病毒载体仍是病毒载体的重要补充途径，具有低毒、低免疫、靶向性和易于组装等优点。

（三）卵巢癌的基因治疗策略

1.自杀基因治疗自杀基因治疗卵巢癌是近年来研究的热点，它是指将编码某些特定酶的基因导入肿瘤细胞并进行表达，表达出的酶可将无活性或低毒的原药（或称药物前体）转化为具有较强细胞毒性的药物，从而杀伤肿瘤细胞。目前有多种原药酶基因及多种原药被用于各种自杀基因治疗系统。其中，单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSVTK）基因治疗是目前应用最多的自杀基因方法。组织特异性启动子OSP-1（ovarian-specific promoter-1）参与调控，使自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（erpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk）与前体药物阿昔洛韦（ganciclovir，GCV）结合，HSV-tk/GCV通过转染肿瘤细胞使tk基因在癌变的组织或细胞中特异地表达，从而使无毒的前体药物GCV转化为有细胞毒性的磷酸化的GCV产物，抑制DNA酶活性，阻止DNA合成，进而杀灭肿瘤细胞。HSV-tk抗肿瘤效应的另一原理是“旁观者效应（bystander effect）”，即转导细胞对非转导细胞的细胞毒作用。已证实腺病毒介导的HSV-tk基因治疗裸鼠间皮瘤、结直肠癌、卵巢癌实验中可使肿瘤消退。体外研究结果显示，与间皮细胞结合的HSV-tk对GCV杀灭肿瘤细胞的作用非常敏感，能增强GCV的“旁观者效应”，使肿瘤生长受到明显抑制。

自杀基因疗法可以实现选择性原位转导和特意性杀伤效应，避免了应用离体技术基因疗法中步骤多、技术要求高、难度大的靶细胞获取及培养、目的基因转导、筛选及回输等过程，已成为卵巢癌基因治疗的主要策略。

2.基因表达封闭——RNA干扰（RNAi）在哺乳类动物细胞中是利用同源双链小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）诱导特异性基因表达抑制，其主要发生于转录后基因水平，所以又称为转录后基因沉默（post transcription gene silencing，PTGS）。双链RNA（double strand RNA，dsRNA）首先被切割为siRNA，siRNA与一些蛋白形成RNA引导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC），介导基因表达沉默。由于RNAi的特异性、高效性、方便性，已成为研究基因功能、肿瘤基因治疗的新方法。Wani等利用RNAi技术抑制肝细胞刺激因子-1在卵巢癌透明细胞瘤中的表达，使其m RNA水平分别降低45%，并诱导其细胞凋亡增加。Bignotti等将脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）的siRNA转染到培养的卵巢癌SKOV3细胞中，导致FAS基因的表达沉默，与对照组相比，HER2的表达下降60%并诱导细胞凋亡。以上研究结果表明，利用RNAi技术对于治疗和预防卵巢癌具有一定的作用并显示出巨大的发展潜力。

3.多药耐药基因治疗化疗是治疗卵巢癌的常用和有效的手段，但肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性（mult idrug resistance，MDR），是造成化疗失败的主要原因。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）与卵巢癌化疗的多药耐药的发生密切相关，当抗癌药物长期作用时，肿瘤细胞中MDR被诱导而扩增，大量表达P-糖蛋白（P-gp）。P-gp与药物分子结合，并由ATP水解提供能量将药物排出细胞，使细胞内药物浓度处于低水平而产生耐药性。利用反义寡脱氧核苷酸抑制MDR基因，可抑制P-gp在卵巢癌细胞中的表达，从而提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。Rein等证实，以腺病毒为载体的Ad5/3MDR 1E1对有化疗抗性的卵巢癌细胞有明显的溶瘤作用，与紫杉醇联合应用效果更加显著。

4.联合基因治疗卵巢癌的发生是多种致病因素、多个环节相互作用的结果，针对一种因素的治疗往往不能使肿瘤的生长受到明显抑制，而各种自杀基因系统发挥作用的机制并不相同。比如CD和HSV-tk融合蛋白的表达可使抑制肿瘤的效应明显增高。自杀基因发挥旁观者效应主要取决于机体自身的免疫力即免疫反应的强弱，自杀基因系统可分别与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素2（IL-2）、干扰素（IFN）等免疫细胞因子有效结合，一方面对肿瘤细胞有直接杀伤作用，另一方面又可使机体对肿瘤的免疫应答提高，发挥其旁观者效应从而使肿瘤生长受到抑制。针对卵巢癌的RNAi技术可同时抑制肿瘤发病的几个关键基因，从而抑制肿瘤生长。

目前已开展的肿瘤基因治疗绝大多数仍处于实验室研究阶段，如要应用于临床还需要较长时间和付出巨大的努力，甚至还有待于某些技术上的重大突破。肿瘤生物治疗将作为手术、化疗、放疗等传统治疗方法的重要补充，在控制微小残余癌灶、延缓复发、提高生存期和生存质量等方面发挥越来越重要的作用。

三、基因芯片技术在卵巢癌中的应用

卵巢癌是一种早期诊断率低而病死率高的妇科常见恶性肿瘤，超过70%的卵巢癌发现时已是晚期，5年生存率不到30%。其主要原因为卵巢癌发病隐蔽，不易早期发现，如果能在卵巢癌Ⅰ期时作出诊断，5年生存率可达90%。因此，寻找卵巢癌肿瘤标志物，提高卵巢癌的早期诊断水平，将意味着争取到最佳的治疗时机，因此，卵巢的早期检测有积极意义。

近年来，通过各种分子生物学方法研究发现除CA125之外一些新的基因与卵巢癌发生和发展密切相关。国外专家研究提示，hk，PI3K，Prostasin，B-cat，HE4等基因有望成为卵巢癌的肿瘤标志物，与CA125联合应用可能提高卵巢癌的早期诊断率。

基因芯片技术的研究开始于20世纪90年代，它是集分子生物学、细胞遗传学、生物化学、生物信息学等多种高新技术为一体的研究手段。目前基因芯片技术在肿瘤相关基因研究、肿瘤基因表达谱分析、肿瘤分子分型及肿瘤基因突变的研究方面广泛应用，对肿瘤生物学研究具有极大优势。近年来，基因芯片技术也应用于卵巢癌研究中，分析卵巢癌基因表达特点，发现卵巢癌早期诊断的分子标志物；分析卵巢癌耐药基因特点，判定卵巢癌对化疗的敏感性；分析各期卵巢癌基因表达特点，预测卵巢癌早期复发倾向，是研究卵巢癌基因表达谱变化的重要方法。

（一）分析卵巢癌基因表达特点，发现卵巢癌早期诊断的分子标志物

通过基因芯片研究人类正常卵巢组织与卵巢癌基因表达的差别，可以识别出在卵巢癌发生和发展中可能有生物学关系的基因。Santin等应用12 533点阵的寡核苷酸芯片分析10例原发性卵巢浆液性囊腺癌、2例转移性卵巢浆液性囊腺癌、5例正常卵巢，结果显示，原发性卵巢浆液性囊腺癌与正常卵巢比较，129个基因上调表达，170个基因下调表达；在转移性卵巢浆液性囊腺癌中过度表达的基因在原发性卵巢浆液性囊腺癌几乎不表达。其中TROP-1/EP-CAM，TROP-2，CD24，Kallikrein6，Kallikrein10等13种基因最有意义。并且用半定量RT-PCR及流式细胞计数仪、免疫组化方法，进一步检测TROP-1/EP-CAM及CD24等基因在原发性卵巢浆液性囊腺癌与正常卵巢的表达差异，证实了CD24和TROP-1/EP-CAM为原发性卵巢浆液性囊腺癌潜在标志物。

近来，有学者陆续发现NOTCH3，E2F3，RACGAP1和HN1，Bcl2-1，COX-2，CD6，beta8 integrin subunit、Claudin-4，S100A，CKB等基因结合妇科彩超及CA125表达情况，能够鉴别卵巢癌和正常卵巢。

（二）分析卵巢癌耐药基因特点，判定卵巢癌对化疗的敏感性

大部分卵巢癌患者在化疗过程中出现耐药现象，目前认为耐药主要是由于遗传上存在差异，如药物应答基因导致肿瘤对药物产生不同的反应。研究发现，P-糖蛋白类、二氢叶酸还原酶（DHFR）、谷胱甘肽转移酶（GST）、周期素、腺苷酸合成酶及癌基因产物cerbB-2，ras，c-myc是与肿瘤细胞耐药性有关的蛋白质分子。Jazzeri为了识别与上皮性卵巢癌化疗耐药相关的基因表达特点，对21例化疗敏感的原发性卵巢癌、24例化疗耐药的原发性卵巢癌和15例铂类化疗后的卵巢癌应用cDNA芯片进行基因表达分析，发现化疗敏感组与化疗耐药组比较，有85个基因表达不同；化疗敏感组与化疗后组比较，760个基因表达不同；化疗耐药组与化疗后组比较，有230个基因表达不同。认为应用cDNA芯片分析卵巢癌基因表达情况能够预测卵巢癌对化疗的反应、鉴别耐药卵巢癌。

（三）分析各期卵巢癌基因表达特点，预测卵巢癌复发倾向

Hartmann报道，仅约20%的卵巢癌患者经过术后系统化疗能够得到长期的生存。为了证实治疗后出现复发时间的早、晚与基因表达异常有关，他们应用30 721点阵的cDNA芯片对79例晚期卵巢癌标本进行基因表达分析，提出14个基因有可能成为卵巢癌治疗后早期复发的预测标志物。

基因芯片技术作为一项新兴的信息分析研究的技术平台，为研究卵巢癌发生、发展的分子机制提供了强有力的手段，对卵巢癌的早期诊断、耐药机制、疗效评价及预后判断显示了广阔的应用前景。

（郝　敏　王岚兰　王文静）

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中英文名词对照

乳腺癌卵巢癌综合征（breast-ovarian cancer syndrome，HBOC）

杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）

癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）

细胞质胸苷激酶1（cytoso licthym idinek inas-1，TK1）

配对盒基因2（paired box2，Pax 2）

Wilms瘤基因1（wilms tumor suppressor gene 1，WT1）

维A酸核受体（retinoic acid receptor，RAR）

维甲类X受体（retinoid X receptor，RXR）

全反式维A酸（all-trans retinoic acid，ATRA）