8.1.2.1 放射自显影的分类
放射性自显影可分为宏观放射性自显影和微观放射性自显影。前者通常是指以视觉感官直接观察自显影图像;而后者是指需要借助于显微镜，才能观察、检查样品的自显影图像。其中微观自显影又可分为光镜自显影和电子显微镜自显影。
宏观自显影(macroscopic ARG)，又称大体自显影，观察范围较大，分辨力低，只能供肉眼或放大镜观察，或根据标本黑度判断示踪的部位和定量，适用于小动物的整体标本，大动物的整个脏器或肢体，以及层析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齿的磨片或剖面等的研究。
光镜自显影(lightmicroscopic ARG)，又称组织学放射自显影，是借助显微镜进行组织学或细胞学观察，分辨能力要求较高。它可以根据银颗粒来判断示踪元素的分布部位和数量的多少，适用于组织切片、细胞涂片等标本的研究，还可以对不同细胞进行比较，并根据不同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的代谢过程。
电子显微镜自显影(electron microscopic ARG)具有高度的分辨能力，能显示出普通光学显微镜不能察知的细微结构。它适用于细胞超微结构，能在不破坏细胞结构完整的情况下，研究某些核酸、蛋白质等生物大分子在生物合成过程和代谢活动的精确定位，能显示放射性物质在线粒体、染色体等亚细胞结构内的精确位置，也可观察动态过程，因而是细胞学研究中的重要手段之一。
8.1.2.2 感光原理
放射自显影原理与光学摄影原理基本相似，只是感光的光源不同。乳胶中的每颗溴化银晶体都是由Ag+和Br－的点阵构成的，当乳胶和含有放射性物质的组织切片或标本紧密接触时，放射性核素放出的射线引起电离作用，带电粒子与乳胶撞击，使带负电荷的Br－发射电子，并移向感光中心，形成阴电荷的静电层;带阳电荷的Ag+也聚集于此，便还原为原子。聚集的银原子虽然极少，但在显影过程中起催化作用，促使溴化银晶体还原为银原子。光化学反应的不断进行，感光中心的银原子聚集到一定大小时，就成了显影中心。由于已形成潜影和未形成潜影的溴化银晶体显影的速度不同，经显影、定影处理，底片上便出现和组织结构中放射性物质分布相应的密度深浅不同的影像，从而显示出放射性核素及其标记物在组织细胞内外的分布状态。
8.1.2.3 常用的感光材料
自显影中常用的感光材料是由卤化银与明胶所组成的乳胶。卤化银是感光致敏物质，它的作用是记录下射线粒子所产生的电子或带电荷粒子的移动过程。明胶是分散剂和卤化银晶体的敏化剂，能使卤化银以微晶体的形式悬浮，并与银离子相互作用生成不稳定的银胶络合物，形成敏化中心。
在乳胶中卤化银以微晶体的形式悬浮在明胶中，核射线的效应、显影、定影等变化都发生在卤化银晶体上。感受了核射线作用的卤化银晶体经显影、定影处理后，便形成金属银颗粒。金属银颗粒在高倍显微镜下是明显可见的棕黑色颗粒，许多金属银颗粒聚集在一起便给出肉眼可见的黑色影像。
放射自显影术常用的感光材料包括各种类型的原子核乳胶、X光片和氚片等。原子核乳胶是自显影中较理想的感光材料，它的银盐颗粒直径为0.2～0.5μm，密度大，一般为1013银颗粒/cm3，分辨率高，主要用于微观放射自显影。市售的X光片两面都涂有保护层，防止乳胶层被划伤，它的乳胶银颗粒较大，平均直径为2.5～3μm，密度较小，一般为6×109银颗粒/cm3。氚片银粒的平均直径是1μm，单面没有保护层，因为保护层将吸收90%以上的3 H发射的β粒子。
8.1.2.4 曝光
曝光过程是溴化银产生潜影的过程。当光线、射线、热和压力等作用于溴化银乳胶时，溴化银中的电子向敏化中心移动，形成带负电荷的静电层，然后带正电荷的银离子便向此处聚集，而变为银原子。聚集的银原子数量很少，大约只占溴化银晶体中银量的十亿分之一。然而这微量的金属银在显影过程中却起着重要的催化作用，可促进溴化银晶体还原为金属银颗粒，因而称为显影中心。溴化银在感光后所发生的这些变化，称之为潜影的形成，如图8－1所示，这些潜影将在显影过程中起着重要的催化作用，因而也称为“显影中心”。潜影的形成与放射性活度、曝光时间及乳胶灵敏度密切相关。
图8－1 潜影的形成
(a)核射线与乳胶作用时，电离产生电子;(b)电子向敏化中心移动，形成一阴电层;
(c)银离子向阴电层聚集，与此同时银离子被还原成银原子;(d)银原子在敏化中心周围集中而形成潜影
8.1.2.5 显影和定影
乳胶经示踪实验标本中核射线作用后，感受核射线作用的卤化银晶体形成看不见的潜影;未感受核射线作用的卤化银晶体则没有形成潜影。这时必须经过显影、定影处理，才能将形成潜影和未形成潜影的银晶体区分开来。形成潜影的卤化银晶体在显影过程中被还原成为金属银颗粒，没有形成潜影的晶体，则通过定影而溶去，这时便成为可以看出的影像。显影、定影处理后，尚需充分水洗，以去除显影和定影时剩留的各种化学物质，再经过干燥，影像方可长期保存。
显影是使形成潜影的卤化银晶体还原成为金属银的过程，是通过显影液完成的。完善的显影液由起显影剂、促进剂、保护剂以及抑制剂组成。显影剂主要起还原作用，一般常用硫酸甲基对氨基苯酚、对苯二酚等;而促进剂主要提供碱性环境，以利于显影过程的进行，常用碳酸钠、硼砂等;保护剂常用亚硫酸钠，用以中和还原剂的氧化产物，使显影液得以持续使用;抑制剂常用溴化钾，其作用为抑制未感光银盐的分解，防止本底升高。
定影是将未感光的溴化银颗粒在硫代硫酸钠的作用下，变成可溶性的硫代硫酸银复合物除去，并将已显现的影像固定下来。定影液一般包括定影剂、保护剂、停显剂和坚膜剂。定影剂为硫代硫酸钠，俗称“海波”，它能溶解溴化银，所以也称溶解剂。常用的保护剂是亚硫酸钠，它能与酸反应形成亚硫酸氢根离子，抑制硫代硫酸钠被酸分解，并析出硫。停显剂的主要作用是终止残余显影液的继续作用。所以停显剂也是一些酸，如:硫酸、醋酸和硼酸。坚膜剂能防止乳胶在定影过程中因膨胀而造成的脱落，以及操作过程中的划伤。常用的坚膜剂有铬钾矾等。
定影后要充分水洗，清除残余的海波、银盐和醋酸。否则在胶片上会形成复杂的银盐化合物，当它析出硫后，便与空气中水和氧反应形成硫酸，而使已显影的银粒形成黄褐色的硫酸根。水洗后的胶片可在空气中静置干燥。
8.1.2.6 自显影的阅读与相对定量
放射自显影片乳胶层中的银颗粒数量(微观放射自显影)或由颗粒形成的黑度(宏观放射自显影)可以反映样品所摄取的放射性核素相对的量和放射性物质在组织内的代谢状态。从定位和分布强度上比较不同脏器、组织或细胞在量上的差异。
常用的阅读方法有光密度法、颗粒数量计算法以及径迹数量计算法3种。光密度法是根据自显影中影像的黑化程度来确定组织中放射性核素相对量的方法。颗粒数量计算法，也称微尺目数法，是利用目镜微尺在显微镜视野下圈定一定范围，或对一定数量的细胞或细胞核，进行射线颗粒数量计数，常用于低能核素和剂量较小的样品，是细胞和亚细胞水平计算射线颗粒数量以显示射线强度的实用方法。径迹数量计算法是计算自显影胶片上由射线粒子所形成的径迹的数量来测定组织和细胞中放射性核素相对含量的方法。
8.1.2.7 放射自显影的制备方法
放射自显影的制备方法可因实验目的和要求的不同而不同，但基本实验操作过程是一致的，大致分5个步骤:①示踪剂的引入:根据不同的研究目的，采用不同的途径，向实验对象引入适合的放射性示踪剂。②标本制备:采集组织样本，制作切片或涂片。总的要求是标本必须有一个平面，以供自显影材料的均匀接触;标本制作过程不能引起示踪剂的流失或移动;标本的厚薄要合适。③放射自显影标本制备:在暗室内向制备好的标本上敷加核乳胶。有接触法、湿贴法、接触湿贴法、液体乳胶浸膜法、揭膜乳胶法等等，可根据不同的要求选择合适的制备方法。④曝光:在避光干燥的条件下，使核射线充分地作用于乳胶。放射自显影的曝光是在低温、干燥、避光、无氧或充满惰性气体的密封容器中，感光材料接受核射线的辐射过程。其曝光量取决于实验标本中示踪剂的放射性活度及曝光时间的长短。⑤照相处理:在充分曝光后，进行显影、定影、冲洗、染色和封固等处理。
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