生前伤诊断的研究现状及研究热点

三、生前伤诊断的研究现状及研究热点

生前伤的诊断是法医学，尤其是法医病理学损伤领域中的一个非常重要但迄今仍未解决的问题之一。随着医学及分子生物学技术的不断发展，许多法医学者亦采用多种不同的方法，诸如电子显微镜技术、组织化学方法、生物化学方法、免疫组织化学方法及分子生物学技术等，从不同的角度对这一问题进行研究，期望为这一问题的最终解决提供科学依据。

（一）电子显微镜技术

随着医学科学及相关学科的发展，生前伤的诊断已从宏观（肉眼观察）到微观（光学显微镜观察）再到超微观（电子显微镜观察），并趋向于多种研究方法的综合运用，比如电镜酶组织化学、电镜免疫组织化学等。随着研究的不断深入，肉眼观察仅作为帮助取材作光镜或电镜观察的一种辅助方法；光镜观察对于损伤动物模型的建立以及一些少有报道的损伤研究仍有一定价值；目前研究热点大多采用电子显微镜技术进行研究。

1．脑损伤头部外伤常造成脑损伤，而脑损伤尤其是脑干损伤常引起死亡。在脑损伤程度较轻时其诊断常较困难。有关脑损伤的诊断问题研究，大多采用各种动物模型进行。

于晓军等采用大鼠脑震荡动物模型，运用血管铸型方法研究闭合性弥漫性脑损伤脑血管改变，在扫描电镜下发现闭合性脑损伤即刻致死和伤后15 min组大鼠脑干部小动脉及其分支可见多数散在的微动脉痉挛，呈节段性变细、扭曲，血管腔直径为2～5 μm。推测在颅脑损伤时，如果是供应脑干生命中枢部位的血管发生痉挛和脑血流改变，超过神经细胞对缺血缺氧的耐受时限时，可能构成脑损伤后迅速死亡机制之一。

胡玲等采用头颅半约束非撞击性旋转暴力致伤方法建立猫脑弥漫性轴索损伤模型，在致伤后不同时间对脑组织进行了HE染色、银染色和扫描电镜观察，发现HE染色未见特征性改变；银染色显示伤后6 h见收缩球形成，伤后12 h达到高峰，持续至24 h。她扫描电镜显示伤后4 h可检见收缩球形成，随着时间延长，其体积逐渐增大，数量逐渐增多，于12 h达到高峰，持续至24 h。她认为扫描电镜对弥漫性轴索损伤的诊断价值优于HE染色及银染色，其发现的形态学改变对弥漫性轴索损伤的诊断及损伤时间推断有一定的参考价值。李兴彪等建立家兔烧死动物模型，用光镜、透射及扫描电镜观察生前烧死家兔气管、肺及心肌的病变，结果显示透射电镜下气管黏膜上皮完全脱落，成堆红细胞和纤维蛋白成分黏附在平滑肌表面；肺Ⅰ型肺泡上皮细胞结构基本连续，线粒体嵴有断裂、缺失；Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛消失，少数Ⅱ型肺泡上皮细胞质膜破损、染色质浓聚、胞质内容丢失；心肌严重变性坏死，细胞膜破坏，线粒体极度肿胀，肌丝溶解并出现收缩带坏死。扫描电镜下见气管黏膜上皮大片脱落，少数区域纤毛上皮稀疏排列，有脱落柱状上皮附着在纤毛上；心内膜的内皮细胞大部脱落，暴露内皮下结缔组织，心肌纤维呈扭曲排列。死后焚尸及正常对照组未见上述变化，认为烧死兔的光镜及电镜下气管、肺及心肌的病理形态学变化，能为生前烧死与死后焚尸的鉴别提供依据。

刘力等利用68例颅脑损伤的尸检和临床病历资料，以及有心内膜下出血的心脏标本，研究发现在颅脑损伤早期主要表现为左心室内膜下出血、浅层心肌出血、心肌层散在灶状变性、横纹消失等心肌缺血性改变；在晚期则见多形核白细胞为主的炎细胞浸润及心肌瘢痕形成等改变。其中有21例出现心电图异常，以窦性心动过速和ST－T改变为主，严重者出现心律紊乱和房室传导阻滞。刘敏等利用34例颅脑损伤尸检资料研究，发现神经源性肺水肿发生率为41．18%。34例颅脑损伤案例中以10～49岁为多见，其发生率为44．44%；颅脑损伤后立即死亡至损伤后6 h内死亡者神经源性肺水肿发生率为41．18%；单一部位严重损伤出血者神经源性肺水肿发生率为69．23%，多部位损伤出血者神经源性肺水肿发生率为23．81%；认为颅脑损伤后神经源性肺水肿的发生与损伤后经历时间及脑损伤部位数量无关，但与脑损伤严重程度有关。

姚青松等对头外伤后短时间内死亡者的脑干组织学改变进行研究，采用HE染色发现脑损伤组可见脑干组织出血、水肿及神经元坏死等改变；非脑损伤组未见上述改变；可疑脑干损伤组也可见上述改变。姚青松等认为在可疑脑干损伤组，部分案例因伤后存活时间较短，单凭HE染色未见明显改变或仅见出血改变，必须结合其他检查方法才能提高脑干损伤致死的诊断率。汪秉康等对11例脑外伤死亡案例，采用肉眼观察、HE染色、轴索嗜银染色及髓鞘染色后光镜观察和扫描电镜观察方法等进行研究，结果光镜下发现的挫伤病变远较肉眼发现的多，并可见大脑及脑干轴索、髓鞘有不同程度断裂、变性、排列紊乱、崩解及坏死，轴索断端亦可查见收缩球。因而认为，在法医学颅脑外伤检查中，除肉眼外，对脑挫伤轻微者，要做多部位的光镜下检查，并尽可能作髓鞘、轴索特染，或加作扫描电镜检查，以便作出正确结论。

2．心脏损伤胸前区受到钝性暴力作用时，可累及心脏引起死亡，但有时确定死亡原因存在困难。有学者采用动物模型对其进行研究。

官大威等用自制机械式弹性拉力打击器以6．7 m/s，8．0 m/s，9．1 m/s及10．0 m/s速度冲击犬心前区，然后采用HE染色、Mallory染色、Masson三色染色及透射电镜技术对心脏组织形态学变化进行观察。结果表明：①以6．7 m/s及8．0 m/s速度冲击后心脏大体未见明显改变，电镜下可见心肌波浪状变；电镜下可见肌原纤维肌节收缩，I带消失或轻度I带增宽乃至肌原纤维断裂。②以9．1 m/s及10．0 m/s速度冲击后肉眼可见心脏挫伤，电镜下见心肌挫伤改变明显，实验观察60 min内心肌血管内皮损伤处已有血小板黏附集聚甚至血栓形成，心肌超微结构损害严重。③研究还发现，同一心脏可有多部位损伤，且损伤程度不均一。这些研究表明钝力性心脏外伤中，虽然无肉眼可见损伤，但在电镜下可见其超微结构有损害。

姚季生等用200 V，5 mA交流电造成家兔心脏电流损伤模型。研究显示，电击死前ECG出现室颤，光镜下心肌纤维广泛断裂，间质出血，小血管周围水肿，房室结细胞核空泡变，胞浆深嗜伊红性；电镜下心肌纤维闰盘撕裂，心肌I带消失，肌节缩短，或I带扩大，肌节拉长，Z线移位，肌原纤维溶解等。

3．骨骼肌损伤瞿勇强等用SD大鼠造成肌肉切创动物模型，在扫描电镜下观察肌肉切创创壁纤维蛋白网的形成和形态，发现生前和死后8 h内的肌肉切创壁，均有纤维蛋白网形成，两者形态无显著差异；死后16 h，肌肉切创创壁无纤维蛋白网形成。

4．皮肤损伤颈部皮肤索沟的生前伤诊断有时仍有困难。刘敏等观察人体颈部皮肤缢沟形态学改变，发现在扫描电镜下缢沟出血及纤维蛋白检出率远较光镜为高；在光镜下生活反应不明显的生前缢沟，在扫描电镜下其表面及断面均可见红细胞及纤维蛋白形成，并可见缢沟部位肥大细胞的形态改变。这些有助于生前与死后缢沟的鉴别诊断。

（二）组织化学方法

1．皮肤组织损伤皮肤生前电击伤与皮肤生前机械性损伤一样，至今仍不能完全与死后短时间的损伤区别开来。竞花兰等用Hartly豚鼠造成电流损伤动物模型，对电流斑皮肤进行非特异性酯酶染色，结果显示生前与死后短时间内的电损伤皮肤胶原纤维上非特异性酯酶活性有显著差别；在相同实验条件下，电击后存活时间越长，电流斑皮肤的酯酶着色反应越深，范围越宽。他们认为非特异性酯酶对于鉴别生前与死后电流斑具有意义。

2．心脏损伤早期心肌缺血的诊断仍较困难。张国华等采用心肌缺血动物模型，用电镜酶组织化学技术观察，发现心肌缺血0．5 h后琥珀酸脱氨酶（SDH）、乳酸脱氧酶（LDH）的活性开始下降，同时伴有致密体的形成和超微结构改变。随着缺血时间的延长，酶活性下降更加明显，最后消失。

3．脑损伤邓平等采用针刺法造成大鼠脑干损伤，嗜银染色结果显示：伤后1～3 h部分神经纤维不规则增粗，少数断裂；6 h后断端膨大呈球形，15 h收缩球较为明显，至24 h收缩球明显且数量增多。改良三色法显示，伤后3～6 h部分髓鞘与轴突之间的间隙增宽；15 h髓鞘明显弯曲，不完全地附着在轴突表面，甚至剥脱，持续到伤后24 h。尼氏体染色显示神经元核周尼氏体在伤后24 h减少。

（三）生物化学方法

早在1965年FAZEKAS和VIRAGOS-KIS即用生物化学方法发现缢死者索沟中游离组胺含量升高。之后，许多学者认为皮肤损伤后组胺、5－羟基色胺含量升高对生前伤的诊断有价值。

孙洪涛等用SD大鼠造成皮肤切创动物模型，用高压液相色谱检测，发现大鼠皮肤生前切创创缘组织中白三烯B₄含量明显升高，死后损伤标本却未见升高。贺立文等也证实这一结果。标本的福尔马林固定时间对检出含量有影响，但一周内仍可检出。

张永亮等建立家兔心肌缺血动物模型，用离子交换色谱法测定，发现缺血时大多数游离氨基酸含量上升，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和组氨酸含量在缺血15 min即有明显增加；但苏氨酸、谷氨酸和游离氨基酸总量却随缺血时间的延长而逐渐下降。认为测定心肌游离氨基酸有助于急性心肌缺血的早期诊断。

（四）免疫组织化学方法

免疫组织化学方法有特异性强、灵敏度高等优点。

1．皮肤损伤研究李朝晖等对SD大鼠不同类型机械性损伤动物模型（切创、枪创、挫伤及索沟）损伤标本及人体标本，用免疫组织化学（SP）法尝试检查了损伤局部组织内表皮生长因子受体（EGFR）表达的变化。发现生前损伤后5～30 min，EGFR阳性率仅为40%；从伤后30 min至2 h，阳性染色率为60．0%～100%。

此外，许多法医学者还对皮肤损伤局部组织中C－反应蛋白、血管内皮生长因子（VEGF）等多种反应物进行研究。

2．心脏损伤研究心脏损伤研究焦点多集中在心脏挫伤及心肌缺血早期诊断两方面。

赵小红等用Wistar大鼠造成心肌缺血动物模型，用免疫组织化学（SABC）法检测，发现心肌缺血30 min组，缺血后心肌即出现肌原蛋白缺失和纤维蛋白原染色增强。陈建国等对大鼠心肌缺血应用免疫组织化学（SABC）法，发现缺血30 min后在缺血局部出现血管内皮生长因子（VEGF）阳性表达。马孟云等用免疫组织化学（SABC）法，发现在冰冻切片上缺血20 min再灌流30 min，再灌流区心肌细胞核呈FOS蛋白阳性着色；但在石蜡切片上，缺血30 min再灌流30 min后，再灌流区才有心肌细胞核呈FOS蛋白弱阳性着色；再灌流60 min后染色增强；正常和单纯缺血组心肌细胞核未见有阳性反应。胡丙杰等用免疫组织化学（SP）法检测，发现C₅在心肌缺血15 min即可出现阳性反应，并随缺血时间延长，其反应面积逐渐增大。胡丙杰等还采用免疫组织化学（SABC）法，发现心肌梗死组24例心肌细胞核及血管内皮细胞核碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）呈强阳性；可疑梗死组21例中有17例心肌细胞及血管内皮细胞核为强阳性染色；正常心脏对照组16例中3例呈弱阳性，其余均为阴性。他们采用免疫组织化学（SP）法，发现梗死心肌、心肌损害中均可见不同程度的肌动蛋白缺染。

官大威等用心肌挫伤动物模型，发现心肌挫伤后2～5 min心内膜下肌层有重度肌红蛋白脱失及中度CK-BB，CK-MM脱失，并沉积于心肌纤维间，同时吸收入血流；波浪变心肌中也可见3种物质的轻度脱失。

3．脑损伤研究张纯兵等用大鼠脑震荡动物模型，用免疫组织化学技术，发现正常大鼠可见少量GFAP阳性细胞，脑震荡6 h后，GFAP表达阳性细胞数目逐渐增多，胞体增大，突起增粗、增多，至伤后7 d达高峰。周亦武等发现脑挫伤后，挫伤灶中央Cyelin D1阳性细胞几乎丧失；1 h后挫伤灶周围Cyelin D1阳性细胞开始增加，3 h至30 d各组挫伤灶周围免疫阳性反应的细胞增加显著；3 h至30 d一直维持在较高水平。杨卫红认为大鼠外周血中白细胞介素2、白细胞介素8的浓度与颅脑损伤时间有关。

曾昭书等观察脑损伤后慢性病程中钙调蛋白（CaM）及一氧化氮合酶（nNOS）的变化。冯强等亦用免疫组织化学（ABC）法观察大鼠闭合性颅脑损伤慢性病程中BCL－2变化。刘敏等用免疫组织化学（PAP）法研究大鼠冲击性脑损伤慢性病程中HSP70及P53表达变化。

（五）分子生物学技术

贺立文等认为可用原位杂交技术检测TNF－α mRNA表达能够用于区别生前伤与死后伤。

周伟、邓平等用原位杂交技术观察人体脑干损伤标本c－fos mRNA表达。

胡丙杰等用原位杂交观察大鼠急性心肌缺血模型中心肌细胞c－fos mRNA表达。

官大威等则研究了小鼠皮肤损伤愈合过程中Fas及Fas ligand（FasL）表达。

此外，法医学者还试图采用其他方法，为生前伤的诊断提供依据。如黄平等应用傅立叶变换红外光谱（FTIR）分析研究了近死亡期皮肤损伤活性差异。他认为FTIR分析技术有望成为法医近死亡期皮肤损伤活性判定的有效方法。