激活的淋巴细胞内细胞因子的检测

1．仪器设备　①12mm×75mm有盖的Falcon管（BD　Catalog　No．2058）；②37℃孵箱5%CO2；③混匀振荡器；④离心机；⑤加样枪、Tips；⑥FACS流式细胞仪。

2．细胞

（1）全血：使用肝素钠抗凝的vacutainer真空采血管（BD　vacutainer　catalog　No．367673），fast　immune不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8h内分析，超过8h会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8h之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

（2）自身血浆中外周血单个核细胞（PBMCs）使用肝素钠抗凝的BD　vacutainer细胞制备管（CPTs）（BD　vacutainer　catalog No．362753）24h内分析。

3．刺激试剂与抗体

（1）PMA（sigma　catalog　No．P－8139）：打开装有PMA的小筒，打开包装，取出1mg包装的小瓶，打开迅速加入1ml的二甲亚砜（DMSO）或无水乙醇。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到100支1．5ml的e．p．管中，每管10μl，取出1支待用，其余99支冻存于－70℃或－20℃冰箱。

（2）离子霉素ionomycin（sigma　catalog　No．I－0634）：打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100支1．5ml的e．p．管中，每支10μl，取出1支待用，其余99支冻存于－70℃或－20℃冰箱，

（3）golgistop或golgiplug，或BFA（catalog　No．555029或554724或347688：在DMSO中调节浓度为5mg／ml，20μl分装，－20℃储存，勿反复冻融。每次实验时用无菌、无叠氮钠PBS　1∶10稀释储存液，BFA终浓度为10μg／ml细胞悬液。

（4）所需相应的抗体，如CD4PerCP－CY5．5，IFN－γ／IL－4。

（5）FACS溶血素：FACS溶血素（BDIS　catalog　No．349202）用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用：全血制备时用于溶解红细胞、固定外表位、辅助通透剂。

FACS溶血素使用前用无离子水1∶10稀释，勿用PBS或其他缓冲液。而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。

（6）FACS通透液：BD推出FACS通透液（BDIS　catalog No．340973）以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足（由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异）。FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。

FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水1∶10稀释，勿用PBS或其他缓冲液。

4．样品的激活与染色　激活时由于莫能霉素的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含莫能霉素。激活过程在有盖的Falcon管中进行。

（1）取一支有盖的Falcon管，编号为病人编号。取全血或PBMCs［细胞数在（0．5～1）×106］500μl，加入500μl　RPMI1640进行稀释1倍，每支管中加入上述刺激剂，混匀。最后在全血中的终浓度：

PMA：20ng／ml全血（取1μlPMA储存液加99μl无菌PBS，混匀后，每个实验体系用2μl）解冻后的储存液4℃保存，2周内用完。

离子霉素：1μg／ml全血（取1μl离子霉素储存液加9μl无菌PBS，混匀后，每个实验体系用10μl）解冻后的储存液4℃保存，2周内用完。BFA：10μg／ml全血（取1μl　BFA储存液加9μl无菌PBS，混匀后，每个实验体系用10μl）解冻后的储存液4℃保存，2周内用完。

（2）37℃，5%CO2，4h孵育（最好用培养箱，松盖）。

（3）取出Falcon管，观察刺激效果，如果有溶血，请重新刺激。

（4）胞外染色：混匀刺激后的血，去200μl于另一支流式管中。按照试剂说明书加入适量的试剂．

（5）溶血：每管加入稀释10倍的溶血素2ml，室温避光10min。取出，1　200转离心5min。弃上清。

（6）破膜通透：加入0．5ml通透剂，室温避光10min。加入2ml含0．5BSA的PBS，1　000转离心5min。弃上清。

（7）胞内染色：加入细胞内的抗体（IFN－γ／IL－4）。混匀，室温避光30min。加入2ml含1%BSA的PBS，1　000转离心5min，弃上清。

（8）上机检测：加入0．5ml的鞘液，在CellQuest软件下，获取10万个细胞。

应用BD　FACS流式细胞仪分析；使用CaliBRITE标准微球，调节流式细胞仪PMT电压，荧光补偿，灵敏度；用CellQuest获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10万细胞；设门圈定FL3＋细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用CellQuest，Attractors分析数据。PMA激活时，血小板可能会被圈在FL3门内，此时可以用FSC／SSC设门。以CD4设阈值时，以FSC／SSC设门可以排除单核细胞。

（肖　漓　董　梅）

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