分子药理学方法

分子药理学属于一门新兴学科，其与传统药理学的最大区别在于，它是从分子水平和基因表达的角度去阐释药物作用及其机制。生命科学的发展由宏观到微观，药理学的发展也由整体水平、器官水平、组织水平深入到细胞水平和分子水平。近代药理学的进展，主要表现在受体理论、离子通道、自体活性物质、信息传递、细胞因子等分子水平上的研究突破。分子药理学是指其学科层次、水平上的科学性和先进性达到“分子水平”，且又属于“药理学”范畴，分子生物学等相关学科的基础知识贯穿其中。当前，分子药理学技术应用的热点主要集中在：药物对基因转录水平的调节；先导化合物活性的高通量筛选；应用蛋白质组学技术发现和鉴定药靶；应用RNAi技术和基因转染技术鉴定药靶等。

（一）药物对基因转录水平的调节

主要技术有Northern印迹法、聚合酶链式技术、报告基因筛选技术。

1．Northern印迹法 继分析DNA的Southern印迹法出现后，1977年Alwine等提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern印迹技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。与Southern印迹相似，Northern印迹也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Southern印迹不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。

2．聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） 是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA。②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（15～20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域。③4种dNTP。④Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌中分离出来的。此酶最适作用温度为75～80℃，但短时间在95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2＋。PCR反应的参数主要由以下几部分组成。

（1）变性：在第一轮循环前，在94℃下变性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为94℃，1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

（2）退火：这是PCR的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度（Tm）从55～70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃，当产物中包含有影响实验的非特异性扩增带时，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高，所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（例如用60℃和94℃）完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

（3）延伸：延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20～85℃，延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加，但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间（10～30 min）的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

（4）循环次数：当其他参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103～105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109～1010。在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。

传统的PCR方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。目前多采用实时PCR原理（real time PCR），其目的在于对扩增产物进行可重复性的定量。由于扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。如今的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时监控。使用者能够根据一个一个的循环知道哪个样品正在扩增。这些即时的数据允许使用者看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。使用者不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性、特异性和有效性。

3．报告基因筛选技术 报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，此类基因所表达的蛋白活性已被确认。报告基因筛选模型是利用基因工程技术将疾病相关基因与报告基因相嵌合，导入模型细胞，观察药物对该基因表达的影响来筛选有效药物。随着生物学的发展，越来越多的孤儿受体被发现，这些受体有可能成为新的药物筛选靶点，对于这些受体的配体及其信号转导的了解都有赖于报告基因筛选模型。

（二）先导化合物活性的高通量筛选

当今的药物合成研究领域利用组合化学结合计算机辅助技术的模式，大大加速了候选药物的合成速度，急剧增加了合成化合物的数目，加上中药本身蕴涵的庞大天然化合物库，药物活性筛选的速度与规模成为制约新药研发的“瓶颈”环节，因此对高通量药物筛选的研究愈显重要。

1．高通量药物筛选技术 是以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，采用自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，再通过计算机对实验获得的数据进行分析处理。

（1）高通量药物筛选：一般要经过药物的初筛和复筛、深入筛选、确证筛选等过程。药物的初筛和复筛是在分子、细胞水平上筛选样品，证明某一样品对该靶点具有药理活性（或亲和力），在初筛中发现的活性化合物，可进入复筛程序。复筛时将选择出的具有活性的化合物，稀释成系列浓度，用初筛时采用的同一模型进行复筛，阐明其对该靶点的作用特点、作用强度和量效关系，发现活性化合物。

（2）深入筛选：是在初筛和复筛的基础上得到的活性化合物。采用与初筛不同但相关的分子、细胞毒性以及其他性质，结合活性化合物化学结构的性质特点，进行综合分析，确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物（样品），作为先导化合物（lead compound）；同时也可结合组织、器官或整体动物模型，证明其药理作用，经过深入筛选，为比较全面地评价活性化合物的药用价值提供更充分的实验资料。

（3）结构优化：获得先导化合物以后，根据实际情况一般需要进行结构优化（根据资料也可以直接作为药物候选化合物进行开发），即进行化合物结构的改造，以便得到活性更高、缺点更少的活性物质。结构优化手段是经过分子设计进行多种衍生物的合成，组合化学技术为结构优化提供了强有力的手段。结构优化后的化合物需要通过复筛过程，以便寻找到高效的新化合物。

（4）确证筛选：是对深入筛选获得的先导化合物或优化后被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究，其内容包括药理作用、药物代谢过程、一般毒性等多方面的筛选，以确定其开发前景。对符合药物要求的样品，确定为药物候选化合物（candidate compounds），进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。

2．高通量药物筛选的特点 由于高通量药物筛选模型中分子、细胞水平上的相互作用，只有采用适当的检测方法才能以可视化的形式反映出来，因此高通量的检测方法是实现高通量药物筛选的关键技术之一。针对高通量药物筛选的特殊要求，一种理想的分析检测技术应具备下列特点：高通量；原位直接检测；检测成本低；靶点无需标记或修饰；精准地反映筛选结果，避免出现假阳性或假阴性结果；适合初次筛选、深入筛选和确证筛选；适合受体、酶、离子通道、细胞等多种筛选模型。应该说，到目前为止并没有一种检测技术能完全具备上述特征。

3．光学检测技术 高通量药物筛选中的光学检测技术具有无需分离即可实现原位检测、筛选通量高、检测成本低、检测仪器成熟的突出优势，只是筛选系统本身就具有理想的光学检测信号的机会并不多，因此在高通量药物筛选中往往要结合标记技术以扩展光学检测的应用范围。这种光学标记检测技术灵活多样，已成为高通量药物筛选中应用最为广泛的检测方法之一。随着研究的深入，发现了生物活性分子键合标记分子后，可能引起构象变化，活性结合位点的覆盖和空间阻碍等一系列不利因素，易造成药物筛选中出现假阳性与假阴性结果。正是由于标记检测技术在应用中存在着诸多不足，近年来与之相对应的一种称为非标记检测技术（label-free technologies）的概念逐渐兴起与流行，迅速成为高通量药物筛选研究领域的新热点。

（1）非标记检测技术：其所涵盖的并不仅限于光学传感器检测技术，其他的一些检测技术，如质谱检测技术、膜片钳电极阵列技术、热分析检测技术等实际上都具有非标记检测的特征。与光学检测技术相比较而言，这些检测技术能够提供丰富的样品与靶点作用信息，准确地反映筛选结果，避免了假阳性或假阴性结果的出现，其优势已不仅是非标记这一点。

（2）解析生物大分子结构的重要技术手段：如核磁共振技术、X射线晶体衍射技术、电子显微镜技术，在高通量药物筛选中的应用价值也逐渐受到研究者的关注。非标记检测技术虽然还受到检测成本、检测通量等方面的限制，目前在高通量药物筛选中应用范围也还没有光学检测技术那么广泛，但在一些筛选模型应用中已经体现出了诸多优势，完善、发展这些检测技术已被视为未来高通量药物筛选研究的重要发展方向。而这些技术的进一步发展与应用，必将表明合理运用现代药物分析技术的重要性，在推动高通量药物筛选技术发展乃至创新药物发现中起着关键作用。

4．发现先导物的新方法 近年来，随着药物化学及相关研究领域的发展，药物研究新技术新方法层出不穷，在大量的实践过程中，已经总结了很多先导物发现的方法。例如，基于组合化学和高通量筛选的药物发现方法等，这些方法以及理论对新药的研发起到了巨大的推动作用。但是，尽管具有较好生物活性的苗头化合物和先导物的发现速度明显加快，新药的整体研发效率依然偏低，每年上市新药的数目并没有明显的增加（每年平均20～30个）。因此，怎样提高苗头化合物的成药概率，提高先导化合物的研发效率，成为新药研究中的“瓶颈”问题。造成这一问题的主要原因是先导化合物发现方法的盲目应用：药物研发机构通常建立了巨大的化合物库，利用高通量筛选方法对化合物库中的分子进行快速的生物活性初步筛选从而发现苗头化合物，经过进一步优化成为先导化合物。这种新药发现模式虽然在初期加速了新药研发的速度，但是由于化合物库中的分子往往不具备结构的多样性，而且经过结构修饰后相对分子质量较大难以兼顾类药性质，导致先导化合物在药物开发过程中由于物化性质、药物代谢性质以及安全性等方面的问题而被迫中止。为摆脱新药研究的困境，药物化学家们发展了很多优化先导化合物新的方法：如药效团与分子骨架迁越方法、基于系统生物学以及电子生物学的药物发现方法，以及基于分子片段的药物发现的方法等，这些方法的应用提高了先导化合物的品质，使其成药的概率提高。

（三）应用蛋白质组学技术发现和鉴定药靶

1．蛋白质组 这一概念是1995年由澳大利亚的Wilkins和Williams率先提出的。其含义是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是一衍生概念，宗旨为通过对蛋白质丰度和性质变化的考察。应能够揭示蛋白质的活动规律。解释基因调节机制，从而可透视到生命现象的本质。将其应用于新药研究中，可通过对疾病与正常细胞中蛋白质组进行比较，发现一些疾病相关蛋白质。这些蛋白质可以成为药物筛选的作用靶点或是相关疾病的分子标志物。

2．特定功能蛋白异常 通常疾病伴随特定功能蛋白异常。决定个体生物性状、代谢特征和病理状况的特殊功能蛋白是潜在的药靶。基因表达及蛋白翻译后加工受到基因之间与蛋白之间的作用、代谢状态和环境等的影响。功能蛋白的表达异常和调节异常通常是疾病发生的分子标志。蛋白质组学是研究特定时空细胞、组织等所含蛋白的表达谱的有效手段，也是寻找疾病分子标记和药靶的重要方法。蛋白质组学研究药靶通常采用比较蛋白质组分析的方法，对于表型发生改变细胞内的蛋白进行比较分析。例如，通过比较生理与病理条件下蛋白质的区别、相应疾患者群与正常人群在对应病理组织／器官内蛋白质的差别，从而探索潜在的药靶。利用该策略发现人肠上皮细胞中“细胞分裂素”可作为免疫疾病治疗的靶标，肺上皮细胞中的“转录生长因子-β”成为肺病治疗的潜在靶标。同样，分析生长因子、中药等候选成分作用后引起细胞内蛋白质表达谱的改变，也有助于寻找到药物的作用靶点。如对巴豆制剂作用下的胃肠道组织蛋白与未使用巴豆制剂作用的胃肠道组织蛋白进行比较分析，可获得巴豆作用于平滑肌的靶蛋白相关信息，再经蛋白测序和鉴定，有望发现巴豆促进胃肠动力作用的关键蛋白成为新的药靶。

3．电泳技术和质谱技术联用 蛋白质组学最经典的技术路线为电泳技术和质谱技术的联用。这种方法适用于大多数样本，包括细胞（如原代培养细胞或各种细胞系）、组织（如肝脏、脑、肾等）、体液（如血清、脑脊液、尿液）等。实验设计通常包含3组样品：正常对照样品、疾病模型样品以及药物处置样品。

（1）疾病模型：不论细胞模型还是整体动物模型，都应该选择与临床疾病病理生理和发病机制相近或类似的模型。将这些样品根据需要制备总蛋白、膜蛋白、核蛋白或是富集糖蛋白等，然后，通过除盐、除核酸或去除白蛋白等处理减少对电泳有干扰的物质。在同样条件下制备和处理后的蛋白质样品在同样条件下通过一维电泳或二维电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）进行分离。

（2）染色：电泳后对凝胶进行染色，常用的方法如考马斯亮蓝染色、硝酸银染色、银蓝染色和荧光染色。银蓝染色是一种改进的考马斯亮蓝染色方法，灵敏度明显高于普通考马斯亮蓝染色，而比硝酸银染色法低，但操作要求不高，染色条件亦容易控制，成本相对较低，质谱兼容性好，它的应用越来越广泛。

（3）蛋白质斑点成像和定量分析：凝胶染色后利用凝胶成像系统和专门的分析软件对凝胶上的蛋白质斑点进行成像和定量分析，并且对不同组别相同位置差异最大的斑点或感兴趣的斑点进行精确切取。然后对这些蛋白质进行胶内酶切，利用胰蛋白酶等蛋白酶将凝胶内的蛋白水解成为肽段，得到的肽段混合物在生物质谱系统中进行分析，最终得到蛋白质肽段的相关数据。将这些数据和已有的数据库进行比对，可以获得蛋白质的相关生物信息（相匹配的蛋白质名称、分子量、等电点等），从而发现药物作用的潜在靶点或与药物作用密切相关的关键蛋白。

（4）验证与探讨：通过Western blot、免疫组织化学等其他方法对得到的蛋白质与药物作用的关系进行验证与探讨，进一步确定其关联性。经过验证后，可以得到药物作用的潜在靶点或药物作用的生物标记物。针对得到的药物靶点，结合蛋白质芯片、酵母双杂交、噬菌体展示等技术，可以对与该靶点相关的具体药物作用机制进行进一步的研究。

4．应用前景 蛋白质与蛋白质相互作用，交叉形成复杂的网络系统，是各项生命活动的基础。从先导化合物设计、靶点的寻找与确认，到药物疗效和毒性的评价，最终到临床个体化给药的实现，都是蛋白质组学发挥技术的舞台。蛋白质组学技术为新药研发提供了新的思路，无疑将对药物研究起到强大的推动作用，将有良好的应用前景。

（四）应用RNAi技术和基因转染技术鉴定药靶

较低浓度双链RNA可使靶基因不能表达出蛋白产物。因此，用RNAi降低候选基因的表达，可观察并检测细胞的表型和生理活动的变化；同时，用基因转染技术增高对应基因的表达可观察基因产物的正向效应。两种方案联用可快速探索该基因的功能，是当前确定药靶的关键技术之一。此两种技术的建立和发展，显著加快了药靶筛选与确认。但是，此类法主要用于对基因表达产物具有很快响应的细胞表型指标进行筛选，不适用于需要长时间积累才能表现效应的基因和对应产物的分析。