【目的要求】 硝酸还原酶是植物氮素同化的关键酶，也是一种诱导酶，与作物吸收和利用氮肥有关，其活性可反映植物的氮代谢状况。
【实验原理】 硝酸还原酶可催化硝酸盐还为亚硝酸盐：
产生的NO－2在酸性条件下可以与对氨基苯磺酸（sulfanilic acid）或磺胺（对－氨基苯磺酰胺，sulfanil－amide）反应生成重氮盐，再与α－萘胺反应生成红色偶氮化合物（对苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。
生成的红色偶氮化合物在520nm波长下有最大吸收值，可用分光光度法测定，并计算出亚硝态氮含量。硝酸还原酶活性可以每小时每克鲜重产生的NO－2微克数表示酶活性［μg／（g· h）］。
根据材料处理不同可分为活体法与离体法，根据反应介质的不同则可分为内源基质法和外源基质法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。内源基质法测定结果可反映硝酸还原酶在实际生长条件下的还原力，而外源基质法测定结果则可反映硝酸还原酶的潜在或最高还原力。
【实验方法】
1．活体法
（1）实验材料与仪器设备
①实验材料：欲测植物材料（如叶类药用植物，实验材料在实验前一天可用硝态氮肥处理，以增强硝酸还原酶活性）。
②仪器设备：分光光度计、真空泵、真空干燥器、天平（感量0．1mg）、恒温培养箱、三角瓶（50ml）、1ml移液管、5ml移液管烧杯、10ml试管、试管架、直径1cm打孔器。
③试剂：0．1mol／L pH 7．5磷酸缓冲液（Na2HPO4·12H2O取30．090 5g与Na2HPO4· 2H2O取2．496 5g，用蒸馏水定容至1 000ml）、30%的三氯乙酸（30g三氯乙酸，水溶后定容至100ml）、0．2mol／L KNO3（20．22g KNO3用蒸馏水定容于1 000ml）、磺胺试剂（1g磺胺，加25ml浓盐酸，用蒸馏水定容于100ml）、α－萘胺试剂（0．2gα－萘胺，用含1ml浓盐酸的蒸馏水定容于100ml）、5μg／ml NO－2标准液（0．10g NaNO2用蒸馏水定容至100ml，吸取7．5ml，再用蒸馏水定容至1 000ml）。
（2）实验内容与方法
①标准曲线制作：取7支10ml刻度试管，按表3－3顺序加试剂，并处理。
表3－3 制作标准曲线
注：可用坐标纸制作标准曲线
②取新鲜植物组织洗净，拭干。如果是叶片可去主脉，打成直径1cm的圆片，若是根、茎可切成0．1cm厚的薄片。
③取上述材料4份，每份50片，称重后分别放入4个50ml三角瓶中，其中1个为空白，3个用于酶活性测定，分别记为重复1、2、3。
④在空白瓶中先加1ml 30%三氯乙酸，然后在每个三角瓶中加入0．1mol／L pH 7．5磷酸缓冲液5ml、蒸馏水5ml（内源基质法）。如果是外源基质法，则将蒸馏水换为5ml 0．2mol／L KNO3。
⑤将三角瓶置于真空干燥器中抽气至样品完全沉入溶液中（约10min）。
⑥取出三角瓶，30℃避光30min；之后在重复中也分别加入1ml 30%的三氯乙酸以终止反应，摇均。
⑦吸取2ml（若反应液浓度太大，可吸取1ml加1ml水）反应液于10ml试管中，加磺胺试剂2ml，α－萘胺试剂2ml，静置30min；比色，记下吸光值（A）（表3－4）；
表3－4 吸光值记录表
⑧从标准曲线中检出NO－2含量（μg／ml），以每小时每克鲜重产生的NO－2微克数表示酶活性，计算方法：
式中：C为根据回归曲线计算的NO－2μg数；Vt为反应液总体积（ml）；Vs为测定时取样体积（ml）；FW为鲜重（g）；t为反应时间（h）。计算时，先分别计算3个重复的结果，再算平均值，为所求结果。
2．离体法
（1）实验材料与仪器设备
①实验材料：欲测植物材料（如叶类药用植物，实验材料在实验前一天可用硝态氮肥处理，以增强硝酸还原酶活性）。
②仪器设备：分光光度计、冷冻离心机、天平（感量0．1mg）、冰箱、恒温培养箱、研钵、剪刀、离心管、15ml具塞试管、移液管、10ml容量瓶、洗耳球。
③试剂：1．5μg／ml Na NO2标准液（1g NaNO2用蒸馏水定容至1 000ml，吸取5ml，再用蒸馏水定容至1 000ml）、0．1mol／L pH 7．5磷酸缓冲液（30．0905g的Na2HPO4·12H2O与2．496 5g的NaH2PO4·2H2O，用蒸馏水定容至1 000ml）、0．025mol／L pH 8．7磷酸缓冲液（8．864 0g的Na2HPO4·12H2O与0．0570g的K2HPO4·3H2O，用蒸馏水定容至1 000ml）、提取液（0．121 1g半胱氨酸、0．0372g EDTA溶于100ml 0．025mol／L pH 8．7磷酸缓冲液）、2mg／ml NADH溶液（2mg溶于1ml水中，临用前配制）、0．1mol／L KNO3（10．11g KNO3用蒸馏水定容于1 000ml）、磺胺试剂（1g磺胺，加25ml浓盐酸，用蒸馏水定容于100ml）、α－萘胺试剂（0．2gα－萘胺，用含1ml浓盐酸的蒸馏水定容于100ml）、30%的三氯乙酸（30g三氯乙酸，水溶后定容至100ml）。
（2）实验内容与方法
①标准曲线制作，同活体法。
②酶的提取，取新鲜植物组织洗净，拭干，剪碎混均，称取1g，放入研钵中冰冻30min，然后加入少许提取液及少量石英砂，研磨匀浆，转移并用提取液定容至10ml，摇均，静置5min，取上清液4ml加入到5ml离心管中，在4℃、4 000r／min下离心15min，得上清液为粗酶液。
③酶活性测定：取4个15ml试管，其中1个为空白管，另外3个为重复1、2、3在空白管中先加入1ml30%的三氯乙酸，然后在每个试管中加入上述酶液0．2ml、0．1mol／L KNO3 0．5ml、2mg／ml NADH溶液0．3ml，在25℃下水浴保温30min。
④保温结束后之后在重复的3个试管中也加入1ml 30%的三氯乙酸，摇均，以终止反应；在4个试管中各加入磺胺试剂2ml、α－萘胺试剂2ml，摇匀，静置15min；520nm比色，记下吸光值（A）。
⑤计算方法同活体法。
【注意事项】
1．亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影响。因此，标准液与样品的测定应在相同条件下进行，并在时间上保持同步，方可比较。
2．取样宜在晴天进行，以保证积累足够的糖类。同时，可在取样前一天施用一定量硝态氮肥，提高硝酸还原酶活性。
【思考题】
1．比较活体法与离体法的特点。
2．为什么测定前一天材料要施一定量硝态氮肥？
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