实验二氧化还原酶活性的测定

实验二　氧化还原酶活性的测定
——以乳酸脱氢酶为例

【实验目的】

1．了解乳酸脱氢酶活性测定原理。

2．学习用比色法测定酶活性的方法。

【实验原理】

氧化还原酶(oxidoreductase)是能催化两分子间发生氧化还原作用的酶的总称。其中氧化酶(oxidase;oxydase)能催化物质被氧气所氧化的作用，脱氢酶(dehydrogenase)能催化从物质分子脱去氢的作用。

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定的方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH和NAD⁺在340nm及260nm处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油-3磷酸脱氢酶等。

本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察NADH在反应过程中340nm处光吸收的减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是:25℃，pH7．5条件下每分钟A₃₄₀下降值为1的酶量为1个单位。

【实验材料】

新鲜兔肉。

【实验器材】

组织捣碎机、5 ml移液管2支、0．1 ml移液管2支、10μl微量注射器一支、恒温水浴锅、分光光度计、试管等。

【药品试剂】

1．50 mmol/L pH6．5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液母液:取溶液A31．5 ml和溶液B68．5 ml混合，调节pH值至6．5。置4℃冰箱备用。

A:50 mmol/L K₂HPO₄:称取K₂HPO₄1．74 g加蒸馏水溶解后定容到200 ml。

B:50 mmol/L KH₂PO₄:称取KH₂PO₄3．4 g加蒸馏水溶解后定容到500 ml。

2．10 mmol/L pH6．5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。

3．0．2 mol/L pH7．5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液母液:取溶液A84 ml和溶液B16 ml混合，调节pH值至7．5。置4℃冰箱备用。

A:0．2 mol/L Na₂HPO₄:称Na₂HPO₄·12H₂O71．64 g加蒸馏水溶解后定容到1000 ml。

B:0．2 mol/L NaH₂PO₄:称NaH₂PO₄·2H₂O31．21 g加蒸馏水溶解后定容至1000 ml。

4．0．1 mol/L pH7．5磷酸盐缓冲液，用上述母液稀释得到。现用现配。

5．NADH溶液:称3．5 mg NADH置试管中，加0．1 mol/L pH7．5磷酸缓冲液1 ml摇匀。现用现配。

6．丙酮酸溶液:称2．5 mg丙酮酸钠，加0．1 mol/L pH7．5磷酸缓冲液29 ml，使其完全溶解。现用现配。

【实验方法】

1．预先将丙酮酸钠溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。

2．取2支石英比色杯，在1支比色杯中加入0．1 mol/L pH7．5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液3 ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零;另一支比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2．9 ml、NADH溶液0．1 ml，加盖摇匀后，测定340nm光吸收值(A)。

3．取出比色杯，加入稀释后的酶溶液10μl，立即计时，摇匀后，每隔0．5分钟测A₃₄₀，连续测定3分钟。

4．以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算每分钟A₃₄₀减少值。

5．计算:按照下面公式计算每毫升组织提取液中LDH活力单位。

【注意事项】

1．实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应储存在－20℃冰箱。

2．酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A₃₄₀下降值在0．1～0．2之间，以减少实验误差。

3．NADH溶液应在临用前配制。

【思考题】

简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。