药用植物苯丙氨酸解氨酶活性测定

【目的要求】　苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL，EC．4．3．1．5）是植物体内苯丙烷代谢途径的关键酶，其活性高低控制着植物体内多种次生酚类化合物、类黄酮植保素、木质素等抗菌物质的合成，因此PAL在植物的次生代谢和抗病代谢中具有重要作用。本实验的目的就在于了解PAL的重要作用，掌握测定PAL活性的原理和方法。

【实验原理】　PAL催化L－苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有强吸收峰，因此可通过测定反应液A290值的变化计算PAL活性。

【实验材料与仪器设备】

1．实验材料　正常生长或经诱导处理的药用植物（或黄化幼苗）等植物新鲜组织。

2．仪器设备　紫外分光光度计、高速冷冻离心机、研钵、移液管（0．5ml、1ml、2ml、5ml各1个）、试管（10ml　5个）、恒温水浴。

3．试剂

（1）0．1mol／L硼酸缓冲液，pH　8．8。

（2）0．02mol／L L－苯丙氨酸（用pH8．8硼酸缓冲液配制）。

（3）提取介质：内含0．05mol／L硼酸缓冲液，5．0mmol／L巯基乙醇，1．0mmol／L EDTANa2，5%甘油，pH　8．3；5%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

（4）6mol／L盐酸。

【实验内容与方法】

1．PAL的提取　取待测植物样品1～2g，－15℃冷冻固定后于研钵中加少量的提取介质、少量石英砂，冰浴研磨匀浆，最后用提取介质定容到10ml，搅拌均匀，4层纱布过滤，滤液在4℃下10　000r／min离心15min，上清液即为待测酶液，4℃保存备用。

2．PAL活性测定　取4支10ml试管（3支测定管，1支对照管），分别加入0．02mol／L L－苯丙氨酸1．0ml（对照管不加，代之为蒸馏水）、硼酸缓冲液（pH　8．8）2．0ml、酶液1．0ml（根据酶活性适当稀释或增加体积），总体积4．0ml。摇匀后置30℃恒温水浴保温60min，加0．2ml 6mol／L盐酸终止反应，若有沉淀需过滤或离心。用对照管调零，在290nm处检测测定管反应液的吸光度A290。

3．结果计算　以测定管反应液每小时A290增加0．01为一个酶活性单位（U）：

式中：Vt为酶液总体积（ml）；FW为样品鲜重（g）；Vs为测定时取酶液的量（ml）；ν为反应液总体积（ml）；t为反应时间（h）。

【注意事项】

1．PAL属于诱导酶，受光（如红光）、受伤、病害感染等可诱导活性增高。

2．除直接用新鲜材料提取的酶液测定外，也可将酶液用冷丙酮制成丙酮粉（可较长时间保存），然后用缓冲液溶解测定。

【思考题】　植物受伤或染病后，诱导PAL活性提高，这有什么意义？