流式细胞仪

流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术等为一体的新型高科技仪器。

【发展简史】　流式细胞仪是为了实现对流动细胞计数的自动化而产生的。1934年Moldvan首次对流动的细胞进行计数，但其设计的装置不能解决大细胞或聚集细胞阻塞玻璃管等一系列问题。随后，鞘液原理的出现成功解决了这些问题。1953年Crosland－Taylor设计了一种鞘液系统。如今几乎所有流式细胞仪生产厂家均采用了这项技术。世界上首台配备荧光镜的流式细胞仪于1970年问世，同年Kamensky利用吖啶橙染色成功将全血中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞进行分离，而1972年LenHerzenberg、BillBonnar等研制的荧光激活细胞分选仪（fluorescence－activated　cell　sorter，FACS）标志着流式细胞仪商品化时代的到来，1974年Becton－Dickinson公司（简称BD公司）将它投入市场，商品名为FACS　I　TM，此后，BD公司又生产了多种型号的FACS仪。20世纪80年代初Joe　Gray等制造出高速分选流式细胞仪，分析速度可达25　000个／s。自从流式细胞仪问世至今，世界上流式细胞仪厂家几经变迁，美国BD公司、Coulter公司等厂家推出的产品，凭借着自己领先的技术和悠久的历史，占领了大部分流式细胞仪市场。进入21世纪流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善，成为细胞学分析领域重要的工具。

国内使用的流式细胞仪主要为Becton－Dickinson公司和BECKMAN－COULTER公司的产品。根据用途主要分为两型：临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。临床型具有以下特点：机体较小，采用固定光路，开机时不需要过多的人工调整，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，适合各种临床细胞免疫学分型、DNA和RNA分析等。科研型具有以下特点：机体较大，分辨率高，功能强大，除了可以完成临床型仪器的检测项目外，还可以进行细胞内的pH、膜电位、染色体核型分析等科研工作。同时具有快速分选功能，将含量较低的细胞从异质性细胞群体中分离出来，可进行单细胞的生物学行为测试，广泛应用于单克隆抗体的筛选和细胞株的纯化。不足之处是这种机型每次开机时均需要进行光路调整，需要有经验的人操作。

【基本原理】

1．分析原理　将待测细胞或微粒制备成单细胞悬液并与特异荧光染料标记的抗体共同孵育后放入样品管中，在恒定气体的压力下待测样品进入流动室。与此同时，利用高压作用将鞘液从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流形成一定角度，使鞘液可以包绕着细胞或微粒高速流动，而样本流处于紊流状态，从而形成1个圆柱形的鞘流。鞘液可将待测细胞包裹并成单行排列，当细胞依次通过流式细胞仪的检测区时，样品流被入射的激光束垂直照射，激光可激发细胞或微粒上的荧光染料产生不同荧光和散射光。在与入射激光平行方向和与入射激光和液流形成平面相垂直方向上分别放置了光测量系统以收集荧光信号和散射光信号。经过光电倍增管接收的光信号可转化为电脉冲信号，再通过模－数转换器将连续的电信号转换为数字化信号，并经计算机处理后，将结果显示在荧屏上或以数据文件形式存储在硬盘上，可根据测定参数的不同选择不同的分析模式。

2．光学原理　流式细胞仪的光学系统由激光器和若干组透镜、滤光片等光学元件及光学通路组成，经激光器激发后，细胞带有的特异荧光被激发，通过不同的光学元件将不同波长的荧光信号送入到相应的电子探测器。目前常用的流式细胞仪的激光器多采用氩离子激光器，光学元件主要是分色反射镜（DL）和滤光片（Filter）。分色反射镜用于选择被测荧光波长，只允许大于特定波长的光通过，而将小于特定波长的光反射到光电检测器。滤光片主要分为三类：长通滤片（long－pass　filter，LP）、短通滤片（short－pass　filter，SP）和带通滤片（band－pass　filter，BP）。长通滤片只允许特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过，而短通滤片正好与长通滤片相反，允许特定波长以下的光通过，带通滤片则允许某一特定波长的光线通过，而其他波长的光全部被阻断。

3．分选原理　流式细胞仪的分选是指根据所测定的各个参数将指定的细胞从细胞群体中分离出来的一种方式。细胞分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。常采用通道式分选和电荷式分选。通道式分选主要在流动室内的捕获管完成，属于封闭式分选。

【特点】　流式细胞仪作为分选细胞的仪器具有以下特点。

（1）可以分析所有制备成单个细胞或生物颗粒悬液的生物样本。

（2）测量速度快，每秒可测量数千个乃至数万个细胞。

（3）可以同时对每个细胞的多参数特征进行测量。

（4）在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，从而可以对分选的细胞进行后续培养、克隆化、观察或进行某些实验。

【主要构成】　主要由流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光学系统、信号检测与存储、显示、分析系统和细胞分选系统几部分构成。

1．流动室（flow　cell或flow　chamber）　是流式细胞仪的核心部件，由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区位于该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。常用的流动室孔径为60μm、100μm、150μm及250μm。

2．激光光源及光束形成系统　流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，发射光波长为488nm。此外，可配备氦氖离子气体激光管（波长633nm）和（或）紫外激光管。流式细胞仪测定的信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束（22μm×66μm），在这种椭圆形激光光斑内激光能量呈正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

3．光学系统　由若干组透镜、小孔、滤光片组成。

4．电子系统　主要包括光电转换器、前置放大电路、模数转换电路和数据处理系统。其中，光电转换器主要功能是将光信号转换为电流信号，主要包括光电二极管和光电倍增管（PMT）；前置放大电路的功能主要是将光电转换器所产生的电流信号转换为电压信号，可调整直流背景噪声为零；模数转换电路作用为将模拟的电压峰值转换为数字化信号，模／数转换芯片的位数和速度决定了数字信号的精度；数据处理系统主要包括电子计算机和各种应用软件。

【显示方式】　主要有单参数直方图（histogram）、二维点图（dot　plot）、二维等高图（contour）、假三维图（pseudo　3D）等。常用二维点图，该显示方式能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在，但细胞点密集的地方难于精确显示。

【技术指标】

1．分析速度　一般流式细胞仪每秒可检测1　000～5　000个细胞，大型机每秒可检测上万个细胞。

2．分辨率　通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到＜2．0%，这是测量标本前用荧光微球调整仪器时必须达到的1个数值。

3．分选速度　一般流式细胞仪分选速度＞1　000个／s，分选细胞纯度可达99%以上。

4．荧光检测灵敏度　对于单个细胞可检测出＜600个荧光分子的细胞，对于两个细胞，只要细胞间的荧光差＞5%即可区分。

5．前向角散射光检测灵敏度　前向角散射光反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪的检测灵敏度是0．2～0．5μm。

6．分选指标　分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。

【主要功能】　可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。

1．散射光信号测量　细胞在通过激光照射区时会向空间360°立体角的所有方向散射光线，散射的信号与细胞的大小、形状、质膜和细胞内部的折射率有关，与收集散射光的方向也有关。散射光主要为前向散射光（forward　scatter，FSC）和侧向散射光（side　scatter，SSC）。FSC信号方向与激光束相平行，强度与细胞大小有关，对于同一个细胞群体，散射光强的细胞大一些；散射光弱的细胞小一些。SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞质内较大的颗粒也有反应，可获得有关细胞内部精细结构和颗粒性质及膜表面光滑程度的有关信息。这两种散射光信号均来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同。在实际工作中常常利用这两个参数组合来区分外周血细胞。

2．荧光信号测量　荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，强度与细胞内能产生自发荧光的分子含量成正比，培养细胞中死细胞／活细胞比例越高，自发荧光越强；②特征荧光，用流式细胞仪测定细胞的特征荧光时，自发荧光对所测定特征荧光是一种本底信号，应设定阴性对照样品加以去除，同时应尽可能地通过选用较亮的荧光染料进行染色、选用适宜的激光和滤片光学系统、采用电子补偿电路等方法提高信号／噪声比，以减少自发荧光的干扰，这是在样品处理与测量中应特别注意的问题。

（1）荧光信号的面积和宽度：荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量的结果；荧光信号脉冲的宽度用于区分双连体或多连体细胞。因为DNA样本很容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，所测得到的DNA含量与单个G2／M期细胞相等，测量结果中G2／M期细胞的比率会增高，影响测量准确性。在实际应用中可通过设门（gating）的方法来去除。其原理是双连体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2－W）要比单个G2／M期细胞大，因此通过设门后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。

（2）荧光信号的线性测量与对数测量：荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当荧光信号经滤光片分离后，不同波长的光信号分别到达不同的PMT，PMT将光信号转换成电信号。

（3）荧光补偿：对于双标记或三标记荧光染色的样品，在应用FCM测量时需要对荧光信号的光谱重叠部分进行校正。在实际测量时，当两波长比较接近，如FITC发射的525nm荧光和PE发射的575nm荧光会发生交叉干扰，而使被测信号失真，测量结果产生较大的误差，需采用荧光补偿方法来解决这种交叉重叠的问题。目前生产厂家都提供有荧光补偿的实用程序，用厂商指定的488nm激光激发的三种荧光染料（FITC、PE、PerCP），在测量中加以正确补偿即可比较容易达到正确测量荧光信号的目的。