流式细胞仪的应用

时间：2022-02-09 理论教育版权反馈

【摘要】：第五节　流式细胞仪的应用一、流式细胞仪在细胞生物学中的应用（一）观察细胞染色质结构由于细胞周期各时期中，染色质的凝集程度不同，染色质越凝集，对酸和热的变性越敏感。

第五节　流式细胞仪的应用

一、流式细胞仪在细胞生物学中的应用

（一）观察细胞染色质结构

由于细胞周期各时期中，染色质的凝集程度不同，染色质越凝集，对酸和热的变性越敏感。吖啶橙（AO）可以嵌入方式与双链结合或以静电作用力与单链结合，变性的单链核酸由发绿色荧光变为发红色荧光，用红色荧光的强度来说明染色质变性的程度。

（二）研究细胞凋亡

凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。凋亡过程分为4个阶段：①染色质浓缩前阶段；②染色质浓缩并被断裂成核小体大小的片段；③细胞器浓缩形成凋亡小体；④凋亡小体被周围细胞或巨噬细胞吞噬，然后被溶酶体分解。

1.细胞形态分析　凋亡早期细胞体积缩小，形成低FSC和高SSC；凋亡后期染色质聚集和核碎裂，FSC和SSC均减弱。该分析无需染色，真实反映细胞形态和活力，但参数无特异性、可变性大。

2.细胞膜结构与功能改变分析

（1）凋亡时胞膜结构的完整性改变，PI可使死细胞着色、荧光素双醋酸酯（FDA）可使活细胞着色，借此鉴定细胞膜的完整性。

（2）胞膜表面标记的改变：机械性损伤细胞（Annexin^－/PI^＋），正常活细胞（Annexin^－/PI^－），早期凋亡细胞（Annexin^＋/PI^－），晚期凋亡或继发性坏死细胞（Annexin^＋/PI^＋）。

（3）细胞内组分的改变

1）线粒体膜电位的改变：凋亡细胞的线粒体跨膜电位会降低，用Mitocapture染色，正常细胞发出红光，而凋亡细胞发绿色荧光；Rh123和JC－1染色，凋亡细胞也发出绿光；DiOC₆染色，正常细胞发出红光或发出绿光，凋亡细胞荧光的强度。

2）溶酶体质子泵：早期凋亡细胞的溶酶体结构基本上保持完整；活细胞、早期凋亡细胞发出红光；死细胞、凋亡晚期细胞红光减弱。

3.分析细胞DNA含量　由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，细胞染色过程中DNA碎片从细胞内逸出，故凋亡细胞内的DNA荧光标记物减少。DNA直方图上显示在G₀/G₁峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，称为凋亡细胞峰。测定DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。凋亡细胞DNA断裂末端标记则大大减弱。TUNEL法标记物常为FITC－dUTP，通过细胞是否标记绿色荧光也可鉴别凋亡细胞。此外，用TUNEL法与PI染色结合分析，即先用FITC－dUTP对凋亡细胞断裂DNA进行标记染色，然后以PI标记变性的DNA，可测知凋亡细胞发生的时相。

（三）胞内Ca^2＋浓度的测定

细胞内Ca^2＋作为细胞信使，调节着多种生理过程。Ca^2＋染料与乙酰甲酯结合后，可被导入细胞内，经胞内非特异性酯酶水解酯键，释放出染料分子。染料在不同的Ca^2＋浓度下发射峰不同，可用比例法测定或直接测得的荧光强度获得Ca^2＋浓度的相对值。

（四）细胞内pH值的测定

双羧乙基碳氧荧光素（BCECF）、双氰基对苯二酚（DCH）等激发光谱或发射光谱是pH值依赖的。在生理pH值范围内，两个发射波长下，荧光强度的比值与pH值有很好的线性关系，故可用荧光强度比值测pH值。

（五）胞膜电位

亲脂性离子荧光染料（Cyanine、Rhodamine123、Oxonol）在细胞膜内外的分布来测量膜电位。

二、流式细胞仪在血液学和免疫学中的应用

1.对淋巴细胞亚群进行分类　分别用CD19^＋、CD3＋、CD16^＋＋CD56＋检测B细胞、T细胞、NK细胞。

2.检测全血中血小板表面相关标志物　常用CD61^＋/Pac－1^＋/CD62P^＋来检测血小板活性，CD61为血小板表面标志物、Pac－1为早期血小板活化标志物即活化的gpⅡb/Ⅲa复合物、CD62P为后期血小板活化标志物。检测时，常用CD61－PerCP的SSC点图设门找出血小板群，然后门内做Pac－1－FITC和CD62P－PE的点图分析。

3.对白血病及淋巴瘤进行免疫分型　CD45的SSC对数取样点图，可将各群细胞区分出来，若再加上1～3个荧光标记的单抗，可分出各亚群。

4.对AIDS检测　可监测病程和治疗过程中患者的免疫状态，预后估计CD4细胞的百分比。

三、流式细胞仪在肿瘤学中的应用

1.肿瘤的诊断　DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标记，细胞的增殖能力大小也反映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用FCM进行细胞周期分析和DNA倍体分析，辅助肿瘤诊断。

2.肿瘤预后估计　通常异倍体肿瘤的恶性度高，复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高，异倍体和较高的S期百分比都是不良预后的标志。用FCM监测肿瘤的DNA倍体可更客观地预测预后。

四、流式细胞仪在药理学中的应用

1.多重耐药性　多重耐药性（MDR）可能是因为跨膜P－糖蛋白（P－gp）的高表达或细胞内药物重新分配异常，从而使细胞内药物在有效作用部位的净摄入量减少所致。应用FITC－P－gp作为探针监测P－gp的表达，并可监测抗肿瘤药物的细胞内聚积程度，判断疗效。另外，还可监测药物在细胞内的重新分配，判断是否在药物作用位点。

2.化疗药物作用机制及疗效评价　用FITC或其他荧光探针标记的BrdU单克隆抗体与已掺入BrdU的细胞孵育，则FITC的荧光强度就代表细胞内DNA合成的情况。因此，可根据细胞周期各时期分布情况，研究化疗药物作用机制（是否周期特异性或时相特异性），并直接了解化疗药物对癌细胞动力学的干扰和影响。

五、质量控制和注意事项

流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。

（一）流式细胞术检测的影响因素

流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰（尤其在间接免疫荧光染色中）或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：①确保标本上机检测前的浓度为1×10⁶个/ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。②使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。③荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。④设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。⑤判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。⑥注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。

（二）流式细胞术的质控和注意事项

1.组织细胞分离方面

（1）手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。

（2）标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。

（3）固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。

（4）单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。

（5）细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即10⁶个/ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应＜2%，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品，至少有20%的肿瘤细胞存在。

（6）石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：取材时应选取无自溶、坏死的组织，对肿瘤组织标本，选取含肿瘤细胞丰富的区域；石蜡组织片的厚度要适宜，最好为40～50μm。过薄或过厚的切片均会影响检测结果；彻底脱蜡，以免残留的石蜡影响酶的消化活性，验证脱蜡是否完全的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，说明蜡已脱净；水化要充分，使组织还原到与新鲜组织相似的状态；注意消化的时间和消化酶的活性。常规使用0.5%胃蛋白酶，pH值为1.5。

2.仪器操作方面

（1）流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态，能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围，分辨率在最好状态，能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

（2）评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数（CV），对于校准样品，其CV值越小越好，CV值越小，说明仪器校正的精度越高。校准样品包括非生物样品（荧光微球）和生物细胞样品（人淋巴细胞、鸡红细胞等）。目前，非生物荧光微球已有商品试剂，CV一般＜2%～3%。

3.资料分析方面

（1）当样品中碎片杂质或团块过多，所测细胞数在20%以下，组方图的基线抬高时，应放弃分析处理。

（2）做细胞周期分析时，样品细胞数应在1万个，排除碎片、杂质和团块，当异倍体细胞数占总细胞数10%以下时，需要结合其他诊断指标，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞数的20%以上，可以确定异倍体的存在。

（3）DNA分析时，正常二倍体细胞组方图CV值＞8%时放弃分析，但肿瘤细胞的CV值＞8%，与肿瘤细胞的异质性有关。另外，DNA倍体分析时，同源组织的不同个体会出现10%的漂移。

（4）DNA倍体标准的质量控制，采用相同个体同源正常组织、同样固定方法、相同的样品处理方法、相同的染色方法、同步染色、同样的仪器检测条件、正常的二倍体组织作为内标准。

（方宁涛　潘銮凤）

参考文献

1.左连富，王凤荣.流式细胞术样品制备技术.北京：华夏出版社，1991

2.宋平根、李素文.流式细胞术的原理和应用.北京：北京师范大学出版社，1992