探针的种类与特点

用于原位杂交的探针可分为双链DNA探针、单链cDNA探针、单链cRNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等，下面分别介绍几种探针及其特点。

（一）双链DNA探针

在原位杂交技术中，双链DNA探针是目前应用最多的探针类型。双链DNA探针主要用于DNA的检测，也可用于mRNA序列的检测。可用基因克隆或PCR法制备双链DNA探针，目前最常用的方法是在细菌的质粒上插入所需的DNA序列，形成重组质粒，再引入细菌体内，经克隆后培养繁殖，而后分离重组质粒，切下目的DNA序列，纯化后即可得到大量的非标记探针。这种方法简便易行，一旦克隆成功，就可运用相同的扩增和标记程序获得大量的标记探针。

双链DNA探针的标记方式较多，有缺口平移法、随机引物法、3＇端加尾和5＇端标记法等，但目前比较常用的是缺口平移法和随机引物法。缺口平移法是一种快速、简便且成本较低的标记方法，能产生高比活性的均一标记放射性核素DNA探针，此法产生的核酸探针的平均长度为600bp。由于随机引物法所标记的核酸探针的量较少（50ng／次），且多为短序列的探针，在原位杂交时易导致高的背景着色，而且必须用限制性内切酶将环状质粒切开才能有效地标记，故在一些实验室多选用缺口平移法进行探针标记。不论用何种方法，标记出的探针的长度与反应体系中DNA酶和DNA聚合酶的比例有关，双链DNA探针的长度随缺口平移反应体系中DNA酶浓度的增高而变短，低浓度的DNA酶常产生1　500bp左右的探针；而高浓度的DNA酶常产生50～200bp的探针。必要时可在标记后取少量探针行1%～2%的琼脂糖凝胶电泳，以确定探针的分子大小。双链DNA探针在使用时需进行变性处理。

（二）单链cDNA探针

单链cDNA探针可用于检测异种远缘生物中的同源序列，可通过克隆含有所需核苷酸序列的噬菌体M13获得，但只克隆DNA互补链中的一条有时是很困难的，尽管仅标记了所需的单链核苷酸序列，而未标记的模板仍以等浓度的水平存在于体系中。因此，在用单链cDNA探针进行杂交时仍然需要进行变性处理。单链cDNA探针的优点是：①不会发生因探针的自身粘连而造成杂交液中探针的消耗；②不形成大的链状连环以至于探针难以进入细胞内。单链cDNA探针的标记方法同双链DNA探针。由于该探针制备比较困难，在原位杂交中使用并不广泛。

（三）单链cRNA探针

近年来，在原位杂交技术中，RNA探针的应用越来越广泛。这是由于：①单链RNA探针分子小，在组织内的穿透性较好，用前无需变性，在杂交过程中也无需重新退火，可以全部与靶核酸配对杂交；②另一方面是因为RNA－RNA杂交形成的杂交体较DNA－RNA杂交体的热稳定性好，从而可以预防和消除较弱的或非特异性结合的探针；③该反义RNA探针不含载体的序列，故减少了非特异性杂交，而在杂交后用RNA酶消化剩余的RNA探针，又降低了背景的非特异性着色。其缺点是：①制备过程相对复杂，需要分子生物学的实验条件；②它对RNA酶敏感，易受RNA酶破坏，因此在操作中要严密防范RNA酶污染。

单链cRNA探针的制备常采用体外转录和标记一步法完成。需注意的是做RNA－RNA杂交时要对RNA酶进行灭活处理。

（四）寡核苷酸探针

寡核苷酸探针常用于检测单个碱基和少数碱基差异，特别适用于基因点突变的分析。寡核苷酸探针可用DNA合成仪来制备，经PCR扩增获得所需的量。人工合成的寡核苷酸探针特点是：①当DNA序列未知时可根据氨基酸的组成进行设计合成；②可用于合成不同序列的探针，对特定基因进行筛选。

由于寡核苷酸探针的片段较其他类型的探针均短，故可用化学或酶法在其DNA序列的两端进行标记，即末端标记（又称加尾标记），一般为3＇端加尾或5＇端标记法，前者利用末端脱氧核苷酸转移酶将带有标记物的核苷酸逐个地添加到寡核苷酸3＇末端上，后者是用T4多核苷酸激酶进行5＇末端标记。寡核苷酸探针的长度以30～50bp为多见，若少于20bp时，该探针的特异性将大打折扣。

寡核苷酸探针的优点是：①以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，方法简便；②由于寡核苷酸探针的分子量小，与等量的双链DNA相比，其探针的浓度高；③可根据目的基因的特异性序列设计探针，因而特异性强；④探针一般较小，组织穿透性好，故所需的杂交时间也短，一般为2～4h；⑤所合成的寡核苷酸探针本身是脱氧核苷酸，对RNA酶不敏感，因此它要比RNA探针更稳定，而且便于操作。但它亦存在一定的缺点：①它与mRNA杂交不如RNARNA杂交稳定。②用于原位杂交时，其敏感性较低，这是因为放射性标记时比活性较低，而且探针短，标记少。应用非放射性标记结合高敏感性的检测方法，可提高其敏感性。③一般只能采用末端标记法标记，检测的敏感性难以提高。④大量合成寡核苷酸探针所需费用较高。