常用固定液的种类及特点

用以固定组织的溶液称为固定液（剂），一般由单一化学物质组成者称为单纯固定液；由多种化学物质混合组成者称为混合固定液。理想的固定液，首先要有强渗透力，能迅速渗入组织内部；其次不会使组织过度收缩或膨胀，并能使组织内易观察的成分凝固为不溶性物质；最后能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对某种染料具有较强的亲和力。常用固定液种类及特点如下。

（一）醛类

醛类固定液主要有甲醛（formeldehyde）和戊二醛。该类固定液易挥发且有强烈刺激气味。

1．甲醛　为一种无色液体，溶于水成为甲醛水溶液。市售原液浓度的实际含量为37%～40%（商品甲醛）。此液久存自行分解，形成白色沉淀为副醛（三聚甲醛或多聚甲醛），可过滤后使用滤液。这种溶液中有甲酸产生，影响细胞核着色。在平时常用的“10%甲醛”是指以10ml甲醛加入90ml的水配制而成，此液实际只有4%的甲醛。甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较少。其固定组织的机制是在组织细胞的蛋白质内形成交联，不破坏蛋白质的整体结构，能很好地保存组织细胞的抗原性，故是常规石蜡切片HE染色和免疫酶组织化学染色首选的固定剂。

2．戊二醛　是电镜标本常用的固定剂，固定速度很快，对细胞质和细胞核的微细结构固定效果好，标准浓度是2．5%。

（二）醇类

醇类固定液主要指甲醇和乙醇，均为无色液体，可与水在任何比例下相混合。常用的固定浓度为80%～95%，以乙醇更为常用。乙醇不仅能固定组织，还可使组织收缩、脱水、硬化、变脆，浓度越高、固定时间越长这种作用越明显，所以不作为组织固定的首选固定剂。醇类固定剂渗透力较弱，是一种蛋白质变性剂，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，故经乙醇固定的组织，细胞核着色不良，不适于染色体的固定。无水乙醇渗透速度很快，宜作糖原固定，但取材须薄，才能固定较好。用70%乙醇可较久地保存组织。50%以上浓度的乙醇可溶解脂肪及类脂体，又能溶解血色素及损害其他色素，所以要证明细胞内的脂肪、类脂体及色素的存在，不能用乙醇作为固定剂。醇类极易挥发，又容易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧。为了吸去其中水分，最好在无水乙醇瓶内放入一些无水硫酸铜粉末。

（三）汞类

汞类固定液是固定液中含有氯化汞的一类固定剂。氯化汞（mercury　bichloride）俗称升汞，为白色粉末或针状结晶，剧毒，必须严格保管。通常用其饱和水溶液（室温的水中饱和度为5%～7%），能使蛋白质沉淀，但对类脂及碳水化合物无固定作用也不破坏，很少单独应用。最常用的是Zenker和B－5液。该类固定液作用机制还不十分清楚，但对蛋白质有强烈的沉淀、凝固作用，因而能充分地固定细胞质和细胞核，并可增加其对酸性染料的亲和力，故对细胞质和细胞核的固定效果好，最适合于造血和网状内皮组织的固定，也是细胞学常用的固定剂。缺点是该类固定液组织穿透力差，适用于较小的材料，并可引起一些组织变硬。另因该类固定液含有汞，固定后必须进行脱汞。

（四）苦味酸盐类

指含有苦味酸（picric　acid）的固定剂。苦味酸在空气中能自燃，在密闭容器中能剧烈爆炸。为安全起见，常制成饱和水溶液储藏保存。最常用的含苦味酸的固定液是Bouin液，能很好地沉淀蛋白，对细胞核固定较好，对脂肪、类脂无作用，其乙醇溶液能固定碳水化合物。苦味酸固定的组织并不硬化，经乙醇脱水后，其硬化程度增加不大。该类固定剂对组织渗透力弱，一般很少单独使用。苦味酸有软化皮肤的作用，经含苦味酸固定液固定的指皮、头皮等组织，易于制作完整切片，无硬化现象。该类固定剂固定后，细胞收缩明显，经乙醇脱水和浸蜡包埋后，收缩加剧，其收缩程度可达50%左右。苦味酸有软化火棉胶作用，一般经含苦味酸液固定者，不宜用火棉胶包埋。苦味酸也有溶化肌腱黏蛋白的作用，用含苦味酸的固定液固定肌腱类组织时，应选用苦味酸氯化钠水溶液（将3g氯化钠加入100ml的苦味酸饱和水溶液中）浸泡（一般3d）后行石蜡包埋。用含苦味酸的固定液固定组织的时间不宜超过24h，时间过长对苏木素等碱性染料染色不利。经其固定的组织往往显黄色，在一般情况下，并不必单独行乙醇或水洗除去全部黄色，因为在随后的乙醇脱水和二甲苯透明时也能除去黄色。若采用流水冲洗易使组织结构膨胀，结缔组织的排列也比较紊乱。必须除黄色时应将固定后的组织块转入70%乙醇中几次，也可在乙醇中滴入少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水。

（五）氧化剂类

氧化剂类固定液有高锰酸盐（高锰酸钾）、重铬酸盐（重铬酸钾）和四氧化锇，后二者更常用。

1．重铬酸钾　为橙红色结晶，有毒，水溶解度约9%，水溶液略带酸性。重铬酸钾为强氧化剂，不能与还原剂如乙醇等混合，与甲醛混合时也不能长久稳定。酸化与未酸化的重铬酸钾，其作用完全不同，酸化重铬酸钾（加入醋酸，pH　4．5以下）的固定作用与铬酸相同，可使蛋白质变为不溶性，保持与生活状态相仿，故对细胞质固定很好。未酸化的重铬酸钾（即未加入醋酸，pH在4．5以上或碱性时）还能固定类脂体，使其不溶于脂溶剂，所以可以固定高尔基体、线粒体、脂肪，但能溶解染色质，会造成细胞核染色不良。重铬酸钾的穿透速度快，组织收缩很小，经重铬酸钾固定的组织对酸性染料染色很好，固定后的组织需用流水冲洗12～24h，或用亚硫酸代替。重铬酸钾配入混合固定液中，如Zenker液、Helly液等，是细胞学的良好固定剂。但必须注意与甲醛混合时需在用前配制，不能久存。重铬酸钾的最适固定浓度为1%～3%水溶液。

2．四氧化锇　通常称为锇酸，是电镜标本必需的固定剂，常用做后固定。锇酸本质不是酸，为强氧化剂，呈淡黄色结晶，宜密封于安瓿瓶中保存，其水溶液呈中性极易还原成氢氧化锇而成黑色沉淀，且不可与乙醇及甲醛混合，遇有机物也即还原成氢氧化锇黑色沉淀，此时不可再用。常用的固定浓度为1%～2%的水溶液。一般纯锇酸水溶液不稳定，为了延长保存时间，往往需在水溶液中加入适量化学试剂，如铬酸（配制方法：可将2%锇酸混合于2%铬酸中，即将0．5g的锇酸溶解于25ml的2%铬酸中），或加入升汞饱和液（一般可按25ml锇酸加入1～2滴升汞比例配制）。锇酸对组织的渗透力极弱，且容易使组织变硬变脆，因此，用它固定的组织块必须小而薄，体积最好＜3mm×3mm×2mm，时间不宜过长。一般在用前配制。锇酸是剧毒品，能刺激眼睛、呼吸器官及皮肤，故开启贮存器时，应十分小心，并需戴上防风镜之类的防护用具。