基因探针和探针探测(

二、基因探针和探针探测(gene probes and probing)

基因探针和探针探测是核酸杂交技术中的一种。基因探针是一段特定的DNA或RNA序列(称为寡核茸酸)。序列通常标记了同位素或非同位素物质。Southern印迹、Northern印迹或菌落杂交等实验中，探针用于探测互补序列。探针探测是检测特定的基因或转录物所做的杂交实验。

1.基因探针的构建与标记

构建基因探针的基本策略是获取靶基因的序列，然后选择这一序列的一部分作为探针使用。基因探针的大小可以从18碱基对到多达几百碱基对。

要构建一个基因探针，所研究靶基因的DNA序列必须清楚。这个基因对一特定的微生物种可能是独特的，在这种情况下，这DNA顺序就有利于检出那种微生物体。或者这个基因可能编码一种某一代谢途径独特的酶，这样一种序列构建出探针就有可能指示土壤或水样品中一群细菌的潜在活性，针对活性检测的探针也被称为功能性基因探针。例如用编码固氮作用酶的DNA序列做成的探针可以用检测特定土壤中是否含有携带固氮基因的细菌。还可以构建另外的探针，用以测定这些机体实际上是根瘤菌属或固氮螺菌属的一些种，或者是蓝细菌。甚至还可以构建更通用的基因探针，因而使检出所有已知细菌成为可能。

探针标记的目的是便于在与靶序列杂交后被检出。典型的探针放射性标记是用放射化学元素(如³²P)标记探针，放射性化学元素被结合到DNA的糖磷酸骨架中。如果标记探针与靶分子杂交，可以被放射自显影检测出来。

非放射性的选择有地高辛配基(digoxigenin，DIG)、生物素或荧光素标记探针，这些物质可以通过化学合成结合到序列中去。不同的标记各自因所结合的抗体或链霉抗生物素蛋白碱性磷酸而被检出，这些物质在与合适的底物反应时会发出信号(图15-5)。

标记的DNA探针类型

图15-5DNA序列的基因探针检出

2.探针检测的过程

探针检测的过程是用标记探针与特异性靶DNA杂交，并检出阳性反应的过程。我们可以用构建某一特定肠道细菌(如沙门氏菌)的基因探针及检测来说明。首先将怀疑有这种病原体的井水水样收集起来，然后通过滤膜过滤。将滤膜上收集的细胞溶解，释放出的细菌DNA经热或碱变性成两条单链DNA(ssDNA)。随后靶DNA固定到硝酸纤维素滤膜上。然后基因探针同样变性成单链，随后加到固定靶DNA的滤膜上，使探针与靶DNA杂交，让这些DNA退火，滤膜冲洗把未杂交的探针冲洗掉，保留下来杂交的探针。最后用颜色变化或照相乳胶变暗指示阳性结果。对放射性标记的探针的检测过程称为放射自显影。放射自显影中，滤膜发出的光子、β粒子或γ射线激活X光片上的溴化银晶体。在冲洗X光片时，溴化银还原出金属银并在X光片上形成可见的银粒或黑点。通过此技术得到的X光片图像可用显微光密度测定法做定量分析。

阳性图像指示³²P探针已与滤膜上的靶DNA退火，表示探针与样品DNA之间已发生杂交。判定其杂交是因为基因探针已经和特异沙门氏菌序列发生退火而被检出。反之，如果没有阳性信号，这就说明不存在有沙门氏菌靶序列。这一探针不会与其他细菌(如芽孢杆菌、假单胞菌)的DNA杂交。

3.基因探针技术的应用

基因探针技术的主要应用有菌落杂交、Southern杂交、Northern杂交、荧光原位杂交、生物芯片、斑点杂交(斑点印迹)。

(1)菌落杂交(colony hybridization)

用基因探针检出生长着混合细菌种群平板上的细菌菌落内的特异基因序列，这种方法被称为菌落转移或菌落杂交(colony lifts or hybridization)。进行菌落杂交时，将一片滤膜轻轻地按在平板上，使每个细菌菌落的细胞黏附到滤膜上。在滤膜上直接溶解细胞，DNA就固定在滤膜上。然后以上述的方法对滤膜进行探针检测和检出。经过这一程序，只有那些含有特异DNA序列的菌落才有放射性信号。因为原始平板含有所有的完整菌落，所以可以鉴别出所需菌落，并保留下来用于进一步研究。

(2)Southern杂交(Southern hybridizations)

Southern杂交也称为Southern印迹法(Southern blotting和DNA印迹法)。这项技术以其发明者E.M.Southern的姓氏命名。这项技术是将琼脂凝胶电泳的分辨力同核酸杂交的灵敏度结合起来。DNA片段在一块琼脂糖凝胶中分开，原位变性，然后通过毛细管作用从凝胶转移到直接置于凝胶上的硝酸纤维素膜或其他结合基质。单链DNA结合在硝酸纤维素膜上，然后同32P或生物素核苷酸标记的单链DNA或RNA探针杂交和检测。例如我们想要知道一个基因是质粒上的，还是染色体上的，可将这个菌株内所有的质粒抽提出来，并用凝胶电泳分离开。质粒DNA用印迹法转换到一种特异性膜上，然后对这个膜进行探针探测。重复一遍，只有含靶DNA序列的DNA分子才能与探针杂交，使那些含靶DNA序列的质粒被捡出。

(3)Northern杂交(Northern hybridizations)

Northern杂交也称为Northern印迹法(Northern blotting，RNA印迹法)，其是一种类似于Southern印迹法的方法，用于分析RNA。从环境样品中抽提出的总RNA可按前述的那样在凝胶上电泳或(或)转移到膜上，而特异RNA分子可由适当的探针捡出。尽管RNA的抽提及稳定性存在问题，这项技术还是能够用于基因表达研究，指示一个特异基因的诱导。这样，DNA序列的检出能提供一个种群中存在一种基因的信息，而RNA的检出提供一定种群中基因表达的信息。

(4)斑点印迹或斑点杂交(dot blotting or Dot hybridization)

斑点印迹或斑点杂交(dot blotting or Dot hybridization)是一项评估特异核酸序列存在与否的技术，这项技术不必进行凝胶电泳。更确切地说，这项技术是将等量的核酸点在硝酸纤维素滤膜上，然后进行探针探测。斑点印迹可用来指示一个序列的存在与否，或用来对序列做定量分析，杂交的相应量或强度与同时点上去的已知样品相比较会估计出样品中序列的量，信号的强度由光密度计测定。

(5)荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)

FISH技术利用带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，无需单独分离出DNA或RNA，探测其中所具有的同源核酸序列，结果可直接在荧光显微镜下观察。

(6)生物芯片(microarray)

生物芯片是指一套DNA探针，通常是从cDNA或基因组克隆纯化出来的PCR产物，存放在固体支持物(一般用显微镜栽玻片)上，其密度可达每平方厘米几百个点。芯片主要用于基因表达。例如从接触应激反应和没有接触应激的细胞中提取RNA、mRNA的cDNA拷贝在扩增步骤中通过加入荧光染料标记的核苷酸而酶促标记。芯片与靶分子mRNA的cDNA拷贝杂交，通过激光扫描和电荷耦合器件(CCD)摄像机检出可获得杂交强度。由于已知芯片单独DNA探针的位置，结果会出现完整的指纹结构或因特异应激反应而表达的基因的信号。在环境微生物学中，生物芯片具有利用一次试验就可筛选饮用水中几百个病原体的潜在能力。