拉曼光谱技术

拉曼散射光谱，最早是由科学家拉曼发现的。1928年，科学家拉曼在实验中发现，当光穿过透明介质时被分子散射的光发生频率变化，这种现象被称为拉曼散射。拉曼效应指的是光照射到物质上发生的弹性散射和非弹性散射。弹性散射的散射光有与激发光波长相同的成分；非弹性散射的散射光有比激发光波长长的和短的成分，统称为拉曼效应。其原理是基于分子的振动(和点阵振动)与转动。拉曼光谱的谱线具有明显的特征：拉曼散射光谱的波数随入射光的波数不同而不同。对于同一样品，同一拉曼谱线的位移与入射光的波长无关，只和样品的振动转动能级有关。拉曼光谱可以提供简单、可重复，且更重要的是无损伤的定性定量分析，无需样品准备可直接通过光纤探头或者玻璃、石英等测量。拉曼光谱研究水溶液中的生物样品和化合物样品可获得最准确的研究效果(水的拉曼散射很微弱)。拉曼光谱一次可以覆盖50～4000波数的区间，可同时对有机物和无机物进行分析，而不用改变仪器参数，只需少量样品即可实现测量。目前重要的拉曼光谱分析技术主要有：单道检测的拉曼光谱分析技术、以CCD为代表的多通道探测器用于拉曼光谱的检测仪的分析技术、采用傅立叶变换技术的FT-Raman光谱分析技术、共振拉曼光谱分析技术、表面增强拉曼效应分析技术。

拉曼光谱分析技术是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术，其信号来源于分子的振动和转动。拉曼光谱的分析方向有：①定性分析。不同的物质具有不同的特征光谱，因此可以通过光谱进行定性分析。②结构分析。对光谱谱带的分析，又是进行物质结构分析的基础。③定量分析。根据物质对光谱的吸光度的特点，可以对物质的量有很好的分析能力。拉曼光谱的应用范围遍及化学、物理学、生物学和医学等各个领域，对于纯定性分析、高度定量分析和测定分子结构都有很大价值(图10-3)。

图10-3　488nm激发的3×10-5M的血红蛋白(Hb)，Hb16O2，和
Hb18O2的共振拉曼谱，567cm-1峰有位移的变化

近年来，拉曼光谱技术在癌症检测方面获得较广的应用。癌症已成为世界性难题，全球每年约有600万人被癌症夺取生命。每年我国有160万～180万人被确诊患癌症。由于晚期患者治愈的可能性很小，因此早期诊断对于提高患者的生存概率显得尤为重要。

水的拉曼散射光谱极弱，而其他生物物质则带有丰富的拉曼信息。细胞和组织是由蛋白质、核酸、糖、脂质、辅酶、维生素等成分组成的结构复杂的生命基本单元，每一种生物分子都有其对应的特征拉曼峰。在组织和细胞癌变过程中，细胞内各组分的结构、含量、构象都会发生不同程度的变化，而早期的组织细胞癌变并不会引起明显的临床症状的医学影像学的变化，但是拉曼光谱却可以在分子水平上揭示癌细胞组织结构与正常细胞组织结构之间的差异。通过一定数量癌变的和正常的器官组织的拉曼光谱的对比研究，从两者差异中找出反映改变的特征标志光谱。拉曼光谱可以对生物材料样品进行测定而不会改变样品的性状，因此应用这项技术对动物组织和细胞进行研究用于医学诊断，为癌症诊断和机制分析提供重要的信息和数据。这对于癌症的诊断具有重要的临床意义。

国内凌晓锋等在2000年发表了应用傅立叶变换拉曼光谱对正常胃组织和胃癌组织的研究，显示了正常胃组织和胃癌组织的拉曼光谱。正常胃组织和胃癌组织的光谱在一些谱峰的强度比和面积比上发生了明显的变化。峰高之间的比在胃癌组织中明显升高；峰面积之间的比在胃癌组织中明显升高。研究结果表明，正常组织和胃癌组织的主要差别反映在蛋白质的O-H，N-H，C=C伸缩振动谱带的强度上。相对于正常组织而言，肿瘤组织的谱峰强度明显强于正常组织，造成这一现象的原因可能是蛋白质中氢键结构和核酸含量在正常组织和肿瘤组织中不同所致。以上研究可以看出癌变后的胃癌组织内部的蛋白质种类和结构发生了变化，核酸和其内部碱基的含量增加。

付莉等从分子水平上找到正常肺组织和癌变组织上的差异。方法是：应用激光显微拉曼光谱法对肺癌变及癌旁正常组织冷冻切片进行分析研究。结果显示：正常肺组织切片的1392cm-1附近的C-H变形振动在癌变组织光谱中向高波数移动约6cm-1；1523cm-1脂类类胡萝卜素的C=C振动谱带在癌变组织光谱中向高波数移动约3cm-1；在正常组织中1610cm-1处谱带的强度明显强于1526cm-1处谱带的强度，而在癌变组织中则相反。结果发现：肺部正常组织和癌变组织的激光显微拉曼光谱有显著差异，这些差异有可能成为组织癌变的判别依据。