原生质体的培养

1）原生质体的培养方法

（1）液体浅层培养法。原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口进行培养（见图5.9）。原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。但原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。

图5.9　原生质体培养方法

（2）固液双层培养法。此法结合液体浅层培养和固体培养的优点，在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养（见图5.9）。固体培养基中的营养成分可被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。但该方法不易观察细胞的发育过程。

（3）固体平板培养法。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（主要是琼脂或低熔点琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养（见图5.9）。该方法原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。但是培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响，另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2天左右。

（4）琼脂糖珠培养法。将含有原生质体的液态琼脂糖培养基滴于培养皿中，待其固化后向其中添加液体培养基并于摇床上低速旋转培养（见图5.9）。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。

2）影响原生质体培养的因素

（1）原生质体来源及活力。分离原生质体所用外植体的生理状态与原生质体的质量和其后代的分裂频率有着密切的关系，如在小麦原生质体培养中，3～6月龄的悬浮细胞系分离的原生质体分裂率比1月龄的原生质体高。

原生质体的起始密度低于一定密度不能分裂，适宜密度在104～105个/mL。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个/mL时，细胞只能分裂一两次，密度在104个/mL以上，植板率（即形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比）常显著提高。

（2）渗透压稳定剂。选择合适的渗透剂和浓度是培养原生质体的关键。渗透压过高，原生质体会皱缩直至失去活力；渗透压过低，原生质体吸水膨胀而破碎。在初始培养时，培养基要保持较高的渗透势，随着原生质体培养时间的延长，可逐步降低渗透势，以提高细胞的耐受力。目前，常用碳源和渗透剂包括蔗糖、果糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇等。当以蔗糖和果糖作碳源和渗透压稳定剂时，细胞不能持续分裂，而用葡萄糖时，原生质体能持续分裂并形成细胞团。现在一个趋势是将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，有利于细胞分裂。

（3）培养基的选择。基本培养基为原生质体的生长提供所需的各类营养物质。即使来源于同一种基因型的原生质体，在不同培养基中的再生能力也不一样。原生质体的培养基基本沿用植物组织培养所使用的或改进型培养基。目前，原生质体培养常用的基本培养基包括KM8P，MS，MT，WPM，B5等。培养基中的附加物质也会影响到原生质体培养效果，如培养基中的激素、无机盐组成、氨基酸和有机酸等。

（4）培养条件。培养条件对决定原生质体是否能持续分裂是非常重要的。不同的物种有着不同的要求和最佳选择，没有一个统一化的程序。

温度：不同的植物细胞原生质体对培养温度的要求不同，如豌豆的适宜温度是19～21℃，烟草是20～28℃，蔷薇是25～30℃等。

光强度：这是一个有争议的参数。Divid等认为高的光强度对新分离出的原生质体是有害的，应在漫射光或黑暗中培养，当完整的细胞壁形成以后，细胞具有了耐光的特性，才可以转移到光下。如苜蓿原生质体只有在黑暗处培养才能形成克隆。而有些报道却认为原生质体的生长需要在一定强度的光照下进行。

p H值：原生质体培养的p H值一般为5.6～5.8，与常规植物组织培养和细胞培养相类似，不适宜的p H值会破坏细胞膜的电荷平衡，影响原生质体的活力。

（5）植物基因型。较早的试验曾证明，矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期受不同基因所控制。基因型与原生质体培养及形态分化存在一定关系，同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所需要的条件不同，造成不同品种在相同条件下的再生能力也不尽相同。基因型影响原生质体的持续分裂和植株再生的现象，已在甜菜、油菜、水稻和棉花等农作物及柑橘和苹果等木本植物中观察到。

（6）激素。激素对原生质体生长发育十分重要。在原生质体培养前期，通常需要较高水平的生长素和细胞分裂素进行适当搭配，才能启动细胞壁的再生。