原生质体制备

原生质体制备

原生质体的制备包括取材与除菌、酶解、分离、洗涤和鉴定五个过程。

取材与除菌。为了让制得的原生质体一般都生存力较强，再生与分生比例较高，常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌，对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2～3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理，最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

酶解。现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种p H值在5．5～5．8的缓冲液，内合纤维素酶0．3%～3．0%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片撕去下表皮切块放入反应液不时轻摇（条件25℃～30℃，2～4小时）反应液变绿。反应液变绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

分离。在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必须进行原生质体的分离。可选取200～400平方厘米的不锈钢网或尼龙布过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。

洗涤。刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养，再生的试剂，应用新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2～4次。

鉴定。只有经过鉴定确认已获得原生质体后，才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形，如果把它放入低渗溶液中，则很容易胀破。把它用荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定光合作用与呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。