筛选及其肥效研究

蚕豆根瘤菌的分离、筛选及其肥效研究

王文丽　李娟　卢秉林

（甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所　甘肃兰州　730070）

摘要：蚕豆接种根瘤菌可以减少田间化肥用量提高蚕豆产量。从甘肃省不同蚕豆种植区采集蚕豆根瘤，采用选择性培养基，分离获得到11株蚕豆根瘤菌，经过蛭石粉和土壤栽培筛选试验，筛选出7株（G1、G2、G6、G7、G8、G10、G11）根瘤菌，它们与临蚕2号蚕豆有效共生匹配效果好，共生固氮力强，具有一定的生产应用价值。

关键词：蚕豆；根瘤菌；筛选

根瘤菌豆科共生体系是生物固氮中最有效的成员，蚕豆作为一种豆科作物，营养价值高、附加值高，是我国大面积种植的豆科作物之一。研究表明，接种根瘤菌可以显著地提高蚕豆的产量，增加土壤肥力。以往对高效根瘤菌的筛选主要以有效性高作为最为重要甚至唯一的指标^[1]，以此筛选出的所谓高效根瘤菌，应用到田间试验中时，却发现有一些并不能充分发挥出其应有的共生固氮潜能^[2，3]，究其原因，一是未能筛选到能适合土壤环境与豆科植物有效共生匹配的根瘤菌；二是大量适应土壤环境的土著根瘤菌与接种根瘤菌进行竞争，土著菌在很多情况下占明显优势，可往往其结瘤固氮能力不强^[4]。因此，对豆科植物进行根瘤菌有效共生匹配筛选就显得十分必要。甘肃省豆科作物面积大，尤其是蚕豆，常年播种面积在140万亩以上^[5]，但是在蚕豆主产区存在蚕豆根系上根瘤有效结瘤较低，严重影响着蚕豆共生固氮效应的良好发挥，为此我们开展了此项研究，以期筛选出适合于甘肃省蚕豆种植区应用的蚕豆根瘤菌。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　蚕豆品种

临蚕2号。

1.1.2　菌株：G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11共11株菌株。

1.1.3　供试土壤

采集于甘肃省农业科学院兰州农场试验地，该土壤属灌淤土，理化性状为：有机质15.0g/kg、全氮1.1g/kg、全磷02.2 g/kg、全钾23.5g/kg、水解氮78.0mg/kg、速效磷28.2mg/kg、速效钾199.9mg/kg、pH值为8.01。

注：本文发表于《干旱地区农业研究》，2010，28（6）：112～115.

1.1.4　YMA培养基：按参考文献^[6]的配方进行。

1.2　试验方法

1.2.1　蚕豆根瘤菌的分离与纯化

分离、纯化参考文献^[7]的方法进行。

1.2.2　蚕豆根瘤菌回接

菌株培养：将供试菌株先接到YMA斜面活化，然后转接于YMA培养液，过夜培养至对数期，其菌株的生长情况用平板法检测，计算含菌量。

灭菌处理：将试验所需用的镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒包好，121℃，灭菌30min。分别称取75g蛭石装入塞有纱布条的塑料杯中，在下层的玻璃瓶中注入50ml蒸馏水，将装有蛭石的塑料杯置于玻璃瓶上，再用牛皮纸包扎好，将其放入高压锅中间灭菌3小时，121℃。

蛭石栽培及接种(双层钵法)将4粒发芽一致，芽长1cm左右的蚕豆种子置于发酵好的根瘤菌液中，浸泡15min（以淹没种子为宜），用无菌镊子夹取其植入装有无菌蛭石的塑料杯中，每杯种植1粒，再沿各种子根部加入该菌液2ml。在底层的供水瓶中装入低氮营养液（液面不能高与上层钵底部），用牛皮纸封口（所用材料均提前灭菌），同时在牛皮纸中间剪一小洞（直径约1cm）。以上步骤均在超净台上进行，然后转入光照强度为6000～10 000Lx左右，昼夜温度为（23±5）℃，日照时数14～16hr的日光室中培养。待蚕豆生长至40～45天后收获。收获时用水冲洗净根，分别测定每株蚕豆的有效根瘤数（以呈现粉红色为标准）、鲜瘤重、植株地上部干物重。

1.2.3　蚕豆根瘤菌发酵液接种盆栽肥效试验

试验为随机区组设计，共设12个处理，4次重复。处理1：施肥、不接根瘤菌；处理2～处理12：施肥、分别接根瘤菌G1～G11，4ml/株；每盆装土7.0kg，调节土壤含水量至25%，然后点种蚕豆种子，6粒/盆，出苗后定植为2株/盆。

根瘤菌液的制备：将冷藏的斜面菌株取2环接种于50ml灭菌的液体YMA培养基中，置于30℃、190r/min旋转摇床上培养24小时，取1ml逐级稀释至10^-8，取100μl于YMA平板上，置于30℃恒温培养箱中培养48小时计数。根据计数的结果调节每瓶中的菌液的浓度到10⁸CFU/ml。

1.2.4　测定项目与方法

土壤项目的测定方法。有机质：重铬酸钾法；全氮：硒粉—硫酸铜—硫酸钾—硫酸消化法（开氏法）；全磷：钼锑钪比色法（碳酸钠熔融）；全钾：火焰光度计法（氢氧化钠碱熔灼烧）；水解氮：碱解扩散吸收法；速效磷：碳酸氢钠法（钼锑钪比色）；速效钾：火焰光度计法（1mol/L醋酸氨浸提）；pH值为：电位法；土壤水分：烘干法。植株全氮的测定方法：硫酸—双氧水—扩散法^[8]。

2　结果与分析

2.1　11株蚕豆根瘤菌的分离及其对临蚕2号蚕豆的侵染力

通过对采集的15株根瘤菌在含有结晶紫的YMA平板上反复筛选与纯化，得到11株快生型蚕豆根瘤菌，它们在YMA平板上生长良好，培养48小时后菌落表面及边缘光滑，均为圆形，产生黏液，菌体为杆状，直径在2～3mm，革兰氏染色均为阴性，G1、G2、G5、G7、G8、G8、G10、G11菌体游动性快，G3、G4、G6菌体游动性慢。在此基础上进一步利用双层钵培养法进行根瘤菌回接试验，参试的11株菌株除G3、G5、G9结瘤数较低之外，其余结瘤数均显著高于不接菌对照，进一步验证了我们分离的11株菌株除G3、G5、G9菌株之外，其余菌株均容易侵染临蚕2号蚕豆，而且它们对蚕豆地上部分干物质积累的增加作用也很显著，与不接菌的对照相比对蚕豆地上部分干物质积累增加18.97%～79.49%。

2.2　11株蚕豆根瘤菌在土壤中对蚕豆的根系发育及结瘤的影响

根据盆栽试验测定结果，接根瘤菌的处理蚕豆根部的结瘤数和根瘤重均高于不接菌的对照，只是接菌株G2、G3、G5、G9的处理，结瘤数和瘤重相对于其他菌株较低，同时，G3、G5、G9处理的根重也显著低于其他株菌，G3处理蚕豆的干根重与对照相同（表1）。

2.3　11株蚕豆根瘤菌在土壤中对蚕豆地上部分长势和干物质积累的影响

表1　接种不同根瘤菌对蚕豆地上部分生长的影响

Table 1　Effects of inoculating different rhizobium on horsebean growth

由（图1、图2）可见，除了接种G3、G5、G9菌株的处理对蚕豆株高无显著影响外，其余的菌株对蚕豆的株高均有显著的增高作用，其中以G1、G6、G7、G10、G11最为显著，它们的株高与对照的株高相比增高16.68%～25.76%；蚕豆接种菌株G3、G4、G5、G9对其地上部分生物产量无显著增加作用，而接种菌株G1、G2、G6、G7、G8、G10、G11均对蚕豆地上部分生物产量显著增加，它们对蚕豆的生物产量与对照的生物产量相比增加6.48%～12.86%。

2.4　11株蚕豆根瘤菌在土壤中对蚕豆地上部分氮素携出量的影响

对盆栽试验蚕豆地上部分秸秆和籽粒中全氮含量及秸秆和籽粒干重的测定，并通过地上部分氮携出量计算，得出：接种菌株G3、G4、G9对临蚕2号蚕豆地上部分氮携出量无显著增加作用，而其他菌株对该蚕豆地上部分氮携出量与不接菌的对照相比增加显著，增幅为10.34%～25.86%（表3）。

表2　不同菌株对蚕豆结瘤和根系影响

Table 2　Effects of inoculating different rhizobium on horsebean root and nodule

3　结果与讨论

第一，分离的11株菌株有3株（G3、G5、G9）菌株对临蚕2号蚕豆侵染不良，有效结瘤数低，有8株（G1、G2、G4、G6、G7、G8、G10、G11）菌株容易侵染临蚕2号蚕豆，有效结瘤数高，而且在双层钵蛭石粉无菌栽培条件下它们对蚕豆地上部分干物质积累的增加作用很显著，与不接菌的对照相比对临蚕2号蚕豆地上部分干物质积累增加18.97%～79.49%。

表3　不同根瘤菌株对蚕豆植株中氮携出量的影响

Table 3　Effects of inoculating different rhizobium on horsebean plant total carrying N quantity

图1　不同菌株对蚕豆株高的影响

Fig1　Effects of different strains on plant heihgt

第二，通过土壤栽培试验进一步验证了双层钵试验的结果，菌株G1、G2、G6、G7、G8、G10、G11对于临蚕2号蚕豆品种和灌淤土栽培条件下有效共生匹配效果好，共生固氮力强，它们对蚕豆的株高和生物产量与对照相比分别增加16.68%～25.76%、6.48%～12.86%，同时，它们对蚕豆地上部分氮携出量显著高于对照14.03%～35.09%。因此，这7株根瘤菌可以作为甘肃蚕豆种植业生产根瘤菌剂开发的参试菌种。

图2　不同菌株对蚕豆生物产量的影响

Fig 2　Effects of different strains on Stems and leaves dry weight