柠檬酸的液态深层发酵

时间：2022-10-22 百科知识版权反馈

【摘要】：柠檬酸的发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通气量及pH等条件。但柠檬酸主要采用发酵法生产，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、温氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层发酵法。柠檬酸发酵是典型的好氧发酵，对氧十分敏感。柠檬酸发酵通气量相对来说并不大。

任务1　柠檬酸的液态深层发酵

柠檬酸的发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过不断变异和选育得到的。菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。

柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通气量及pH等条件。一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸，温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量，通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液黏度而增加溶解氧，因此产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌丝体大量繁殖，造成溶解氧降低，会使产酸量迅速下降。下面介绍我国以薯干粉为原料的深层发酵工艺。

一、生产菌种

1．柠檬酸产生菌

很多微生物都能产生柠檬酸，例如黑曲霉、温氏曲霉、棒曲霉、芬曲霉、淡黄青霉、桔青霉、梨形毛霉等。但柠檬酸主要采用发酵法生产，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、温氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层发酵法。

2．代表性菌种

当前生产上使用的具有代表性的菌种是：Co827、γ－130和γ－144－130、T419等。

二、生产工艺条件

1．碳氮比

薯类原料由于产地等客观条件不同，其组织中各种物质的含量各异，尤以蛋白质含量相差较大。一般甘薯蛋白质含量为6%～7%，用这种薯干发酵，以现有生产菌种可不需调节含氮量，而西北产区的甘薯干含蛋白质高达8%～9%，超出现菌种所需。木薯干含蛋白质仅1．7%～2．6%，需用玉米粉、米糠、麸皮等有机氮源和适量的无机氮源来补充。

我国用柠檬酸薯干粉为原料的深层发酵工艺流程，基本如图4－15所示。

图4－15　薯干原料发酵工艺

2．温度

据报道，黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在28～30℃时，柠檬酸产率最高，发酵速度也最快。超过35℃时，虽初期产酸较高，但最终产酸率低。

为了节约降温能耗，我国在选育薯干发酵菌种时有意地提高驯育温度，故可在（37±1）℃的条件下发酵，但超过42℃的时间过长会影响发酵，且杂酸生成较多。在正常的发酵过程中，随着柠檬酸的积累，pH逐步下降，而草酸逐步被转化，至发酵结束时，总杂酸量为5～7g／L。

3．pH

发酵的最适pH分为起始和过程中的pH。试验表明：薯干发酵培养基灭菌前将pH降到4．0，灭菌后pH为5．0时，发酵效果较好，低于此值效果下降。

4．控制生物量

正常的发酵液中生物量应控制在12～20g／L，过多的生物量会影响氧的溶解，增加发酵罐搅拌功率，且消耗了大量葡萄糖（一般认为每增加1g生物量，要消耗1g以上的葡萄糖）。薯干粗粮发酵，因本身有大量粗纤维，所以生物量要达到22g／L。

5．严防缺氧

柠檬酸发酵是典型的好氧发酵，对氧十分敏感。当发酵进入产酸期时只要有几分钟的缺氧时间，就会对发酵造成严重影响，甚至完全失败。

6．孢子接种数与菌体的特征

柠檬酸发酵液中的菌球体是由一个或数个孢子在生长过程中通过物理作用而形成的。菌球体的大小和数量关系到发酵的成败。一般来说，菌球体越小越多，产酸就越高，发酵周期也越短。菌球体的大小和数量与孢子接种量有关。

接种孢子数与菌球体量（个／mL）成正比，与菌球体直径成反比。孢子数不足，菌球体大或大小不匀。实践证明，种子罐菌球体直径平均在0．2～0．5mm，移入大罐后的菌球体直径增长至1．0～2．0mm的范围内为较佳值。菌球体最佳浓度为280个／mL，若菌球体浓度低于120个／mL，柠檬酸的积累速度和转化率都下降。若菌球体浓度高于360个／mL则前期产酸快，后期缓慢，孢子数无限多，醪液呈糨糊状，不利于发酵。

薯干原料深层发酵大罐的菌球体直径小于0．1mm，以菌球体浓度高于1000个／mL且表面毛糙为佳。尚未发现因菌球体浓度超过此值而影响发酵的实例。

7．通气量

柠檬酸发酵通气量相对来说并不大。通气量不是一个固定值，应根据培养基的质量、菌种生长需要、发酵罐的结构及其搅拌桨叶的形式和圆周线速度以及罐压而定。一般规律是，发酵罐容积越大，培养液层越厚，搅拌转速越快，则通气量越小。通气量过大，菌体过早进入衰老期，不利于CO₂的固定，且动力浪费过多。氧的溶解度也与搅拌转速、罐压成正比关系；与温度和培养基黏度成反比关系。掌握这些原则，根据菌体的代谢规律来调控适宜的通气量以取得最佳的发酵效果。

在同等条件下，一般通气量：机械搅拌式发酵罐＜喷环式搅拌发酵罐＜内循环无搅拌式发酵罐。

8．孢子直接接种的优缺点

孢子直接接种即所谓的一级接种工艺，目前大多是作为当种子罐种子（二级种子）出现质量问题或因生产中的突发事件而二级种子不能及时供应时的一个补救措施。实际上，孢子直接接种完全可以作为正常生产工艺使用，其优点如下。

①直接接入发酵罐培养液中的孢子数与接进种子罐的孢子数相同，则与二级接种所产生的生物量基本相当，因为在种子罐内不会再繁殖新孢子。

②我国现用菌种、种子罐与发酵罐培养基配方基本一致，一级的种子从孢子开始一直处于同一生长条件，生长环境随孢子的成长而变化，即始终为菌体生长创造一个有利的环境。

③如培养基或培养条件出现不可预见的异常因素，则孢子比菌球体更能适应。

④能保持较小的种龄。前期产酸稍慢，培养基pH＞3．0的时间延长，有利于淀粉的充分糖化，后期产酸较快，后劲较足，则残糖较低。

⑤减少一次接种操作就减少了一次染菌机会，同时节约了相应设备的投资及能耗。

9．斜面培养基与菌种传代的关系

目前通常用自制的4～6°Bé麦汁或米曲汁琼脂斜面培养基，但常因原料或制作方法上出现问题，培养基质量不稳，使菌种生长不良。例如：浓度过高或营养过剩，则斜面下端不生孢子或孢子生得细小、菌膜增厚而出现皱纹，反之则菌膜变薄、孢子细小。这种斜面菌种属不良菌种。生产上要求使用优质的斜面菌种且能稳定传代。

10．麸曲三角瓶菌种的培养工艺

我国目前仍沿用三角瓶麸曲培养生产菌种孢子的工艺，这是我国在发酵工艺方面落后于国外用干孢子培养器培养干孢子的关键原因。