柠檬酸产生菌的分离及其液体发酵

实训25　柠檬酸产生菌的分离及其液体发酵

一、实训目的

以柠檬酸产生的黑曲霉为代表，学习微生物的分离、纯化、种子培养、发酵、产物提取及鉴定等实验，使学生能够系统地掌握柠檬酸产生菌的分离及发酵的基本实验方法和技能。

二、实训原理

柠檬酸又名枸橼酸，学名α－羟基丙烷三羧酸，在食品工业、医药工业、化学工业、美容品、化妆品等领域应用极广。现代柠檬酸生产均采用黑曲霉作为生产菌种。

黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）和戊糖磷酸途径（HMP）转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO₂，继而形成乙酰辅酶A。

丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸；磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸。

生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸在柠檬酸合酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。

一般能量代谢中，乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羧酸（TCA）循环，通过三羧酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌而言，由于顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合酶的活性很高，造成柠檬酸大量积累。草酰乙酸仍通过丙酮酸羧化提供。

在正常情况下，柠檬酸不会在细胞内积累，因为柠檬酸是代谢途径的一个中间产物，而且它还是黑曲霉的碳源。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，三羧酸循环中的α－酮戊二酸脱氢酶受阻遏，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外（图3－28）。

图3－28　糖代谢示意图

葡萄糖经转化生成柠檬酸的理论得率按其总反应式计算为106．7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计，则为116．7%。总反应式为：

2C₆H₁₂O₆＋3O→─22C₆H₈O₇＋4H₂O