任务5.3菌种保藏方法

任务5.3　菌种保藏方法

菌种保藏是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染，以便于研究、交换和使用。而狭义的菌种保藏的目的是防止菌种的退化、保持菌种生活能力和优良的生产性能，尽量减少、推迟负变异，防止死亡，并确保不污染杂菌。

由于各种微生物遗传特性不同，适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和操作的简便性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法。

5.3.1　斜面低温保藏法

1）实训目的

（1）了解斜面低温保藏法的基本原理。

（2）学习并掌握斜面低温保藏法的操作步骤。

2）实训材料、仪器

（1）菌种

生长旺盛的细菌、酵母菌、放线菌和霉菌菌种。

（2）培养基

①琼脂斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基斜面、麦芽汁琼脂培养基斜面、高氏1号培养基斜面、马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面。

②液体培养基：牛肉膏蛋白胨培养液、麦芽汁培养液等。

（3）仪器及其他用具

无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、酒精灯、接种环、普通冰箱、三角瓶等。

3）实训步骤

（1）斜面低温保藏法

将生长旺盛的菌种接种到适宜的琼脂斜面上，置37℃培养箱孵育。待其生长良好后（如果是放线菌或霉菌应等其孢子形成），置于4℃冰箱中保藏。间隔一定时间更换培养基进行转种。具体操作步骤如下：

①贴标签

取各种培养基斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面的正上方，距离试管口2～3cm处。

②接种

将待保藏的菌种用接种环以无菌操作方法移接至相应培养基斜面上。细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子。

③培养

将细菌置于37℃恒温培养箱中培养18～24h，酵母菌置于28～30℃恒温培养箱中培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃恒温培养箱中培养4～7d。

④保藏

待菌株长好后，直接放入4℃冰箱中保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或更换无菌胶塞，亦可用溶化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。

保藏时间依微生物种类不同而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存2～6个月，保藏到此时间即移种一次；而不产芽孢的细菌最好每月移种一次；假单胞菌2周移种一次。

此法的优点是简便，易于推广，但此法的缺点是菌种容易变异，污染杂菌的机会较多。

（2）半固体穿刺保藏法

①贴标签。取无菌的牛肉膏蛋白胨半固体深层培养基试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴在距离试管口2～3cm处。

②穿刺接种。取细菌斜面菌种管一支，用接种针挑取菌种少许，朝深层琼脂培养基中央直刺至接近试管底部（切勿穿透到管底），然后沿穿刺线抽出接种针，塞上棉塞。

③培养。将接种过的培养基试管置于37℃恒温培养箱中培养48h左右。

④保藏。待菌株长好后，直接放入4℃冰箱中保藏。此种方法一般可保存半年至一年。

4）注意事项

①在保藏期间应定期检查存放的房间、冰箱等的温度、湿度，各试管的棉塞有无长霉现象，如发现异常则立即取出该管重新移植，并经培养后补上空缺。

②大量保存菌种每次移植时，各菌株的菌名、所用培养基一定要细心核对准确无误。

③每次移植培养后，应与原保藏菌种的信息逐管对照，检查其培养特征，确实无误再进行保藏。

④斜面保存的菌种，一般每株菌应保藏相继的三代培养物，以便对照。

5）实训结论

表5.1　菌种生长情况记录表

5.3.2　沙土管保藏法

1）实训目的

①了解沙土管保藏法的原理。

②学习并掌握沙土管保藏法的操作步骤。

2）实验材料、仪器

①菌种：霉菌、芽孢杆菌，培养至长满孢子和芽孢。

②试剂：10%HCl、蒸馏水等。

③仪器及其他：试管、接种环、40目和100目筛子、无菌吸管、酒精灯等。

3）实训步骤

在干燥条件下菌种细胞处于休眠和代谢停滞状态，以此达到长期保藏菌种的目的。保藏载体有沙土、滤纸、麸皮等，最常用的是沙土管保藏。此法适用于生芽孢的细菌、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适用于保藏无芽孢的细菌和酵母菌。因此在抗生素工业中应用较广且效果好，但应用于营养细胞效果较差。具体操作如下：

（1）沙土的准备

①沙处理：将河沙过40目筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡（用量以浸没沙粒为宜）2～4h或煮沸30min，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至pH值接近中性，烘干或晒干，备用。

②土处理：取非耕作层瘦黄土（不含或尽量少含有机质），加自来水浸泡洗涤数次，直至pH值接近中性，然后烘干粉碎，过100目筛，去除粗颗粒后备用。

（2）混合和装管

将沙与土按2:1或3:1或4:1（W/W）比例混合均匀装入试管（10mm×100mm）中，装至约7cm高，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎好，121℃灭菌30min，然后烘干。

（3）无菌检查

任取灭菌后的沙土管一支，接种到牛肉膏蛋白胨培养液或麦芽汁培养液中，30℃培养2d以上，检查有无杂菌生长，确信灭菌彻底后方可使用。如发现有杂菌生长，经重新灭菌后，再做无菌试验，直至合格。

（4）沙土管菌种制备

用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏菌种斜面上，用接种环轻轻刮取菌苔并搅动，制成菌悬液。另用1支1mL无菌吸管吸取制备好的菌悬液0.1～0.5mL，放入沙土管中，并用灭菌后的接种环搅拌均匀，塞好棉塞。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。

（5）干燥

把加好菌悬液的沙土管放入干燥器中，器内用培养皿盛P₂O₅或无水CaCl₂作干燥剂。干燥剂吸湿后及时更换，几次以后即可干燥。或可用真空泵连续抽气3～4h，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。

（6）保藏

干燥后的沙土管可视具体条件而采用适当的方法进行保藏。可直接放入冰箱中保存；可用石蜡封住棉塞后置冰箱中保存；也可放入简易干燥器中于室温下保存；还可用喷灯在棉塞下面部位熔封管口，然后进行保存。

4）注意事项

①沙土管经灭菌后要检查其灭菌效果，如有异常要继续多次灭菌。

②沙土管中菌液装量不宜过多，一般装量为试管高度的2/3。

5）实训结论

将实训结果记录于下表中。

表5.2　菌种生长情况记录表

5.3.3　冷冻真空干燥保藏法

1）实训目的

①了解冷冻真空干燥保藏法的原理。

②学习并掌握冷冻真空干燥保藏法的操作方法。

2）实训材料、仪器

①菌种：细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。

②培养基：适合培养待保藏菌种的斜面培养基或琼脂平板。

③仪器及其他：脱脂牛奶、P₂O₅、无水CaCl₂、10%HCl、安瓿管、无菌吸管、冷冻干燥装置等。

3）实训步骤

（1）准备安瓿管

安瓿管一般用中性硬质玻璃制成内径为6～8mm。先用10%HCl浸泡8～10h，再用自来水冲洗至中性，最后用蒸馏水洗1～2次，烘干备用。将标有菌名、接种日期的标签放入安瓿管内，字面朝向管壁可见，管口塞上棉花，于121℃灭菌30min备用。

（2）制备脱脂牛奶

将新鲜牛奶煮沸，除去表面油脂，再用脱脂棉过滤并3000r/min，离心15min，除去上层油脂。如使用脱脂奶粉，可直接配成20%乳液，然后分装，高压灭菌，并做无菌试验。

（3）制备菌液

吸取3mL无菌牛奶移入菌种（16～18h的培养物）斜面试管内，用接种环刮下培养物，并轻轻搅动，再用手搓动试管，制成均匀的细菌悬液。

（4）分装菌液

用无菌的长颈滴管将菌悬液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL（一般装量约为安瓿管球部体积的1/3）。注意不要使菌悬液粘在管壁上。

（5）菌悬液预冻

将装有菌悬液的安瓿管口外的棉花剪去，并将其余棉花向里推至离管口约15mm处，再将安瓿管上端烧熔，拉成细颈，将安瓿管用橡皮管连接在U管的侧管上，并将安瓿整个浸入装有干冰和95%乙醇的预冻槽内（此时槽内温度为－50～－40℃）或放在低温冰箱中（－45～－35℃）进行预冻，可使悬液冻结成固体。

（6）冷冻真空干燥

将装有冻结菌悬液的安瓿管置于真空干燥箱中，开动真空泵进行真空干燥。15min内使真空度达到66.7Pa，被冻结菌悬液开始升华，继续抽气，随后真空度逐渐达到26.7～13.3Pa后，维持6～8h，干燥后样品呈白色疏松状态。注意使用真空泵时要严密封闭，勿使漏气。

（7）熔封安瓿管封口及保藏

待菌种完全干燥后即从干燥缸内取出安瓿，先将安瓿管上部棉塞下端处用火焰烧熔并拉成细颈，再将安瓿管接在封口用的抽气装置上，开动真空泵，室温抽气，当真空度达到26.7Pa时继续抽气数分钟，再用火焰在细颈处烧熔封口。置4℃冰箱中或室温下避光保藏。

（8）恢复培养

当须使用菌种时，先用75%乙醇消毒安瓿管外壁，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，再滴数滴无菌水于烧热处，使管壁产生裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中慢慢地进入管内，然后将裂口端敲断，这样可防止空气因突然开口而冲入管内致使菌粉飞扬。将合适的培养液加入冻干样品中，使干菌粉充分溶解，再用灭菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，置最适温度下培养。

4）注意事项

①进行真空干燥过程中，安瓿管内的样品应保持冻结状态，这样在抽真空时样品就不会因产生泡沫而外溢。

②熔封安瓿管时，火焰要调至适中，封口处灼烧要均匀。若火焰过旺，封口处易弯斜，冷却后易出现裂缝，从而造成漏气。

5）实训结论

将恢复培养后的菌种生长情况和菌落特征记录于下表中。

表5.3　菌种生长情况记录表

5.3.4　液氮超低温保藏法

1）实训目的

①了解液氮超低温保藏法原理。

②学习并掌握液氮超低温保藏法操作。

2）实训材料、仪器

①菌种：制备保藏的细菌、放线菌、酵母菌或霉菌。

②培养基：适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基或琼脂平板。

③试剂和溶液：含20%或10%甘油的液体培养基等。

④仪器和其他用具：液氮冰箱、控速冷冻机、安瓿管、吸管、酒精喷灯等。

3）实训步骤

该法是将保存的菌种用保护剂制成菌悬液密封于安瓿管内，经控制速度冻结后，贮藏在－150～－196℃的液氮超低温冰箱中。这是鉴于有些微生物用冷冻真空干燥法保存不成功，采用其他方法也不易保存较长的时间，根据用液氮冰箱贮藏冻结的精子和血液等先例的启示发展而来的一种保藏方法。这种方法已被国外某些菌种保藏机构作为常规的方法应用。其操作程序并不复杂，关键在于要有液氮冰箱等设备。

（1）制备安瓿管

用于超低温保藏菌种的安瓿瓶必须用能经受121℃高温和－196℃冻结处理而不破裂的硬质玻璃制成。如放在液氮气相中保藏，可使用聚丙烯塑料做成的带螺帽的安瓿管（也要能经受高温灭菌和超低温冻结的处理）。安瓿管大小以容量1.2mL为宜。

安瓿管用自来水洗净，再用蒸馏水洗两遍烘干。将注有菌名及接种日期的标签放入安瓿管上部，塞上棉花于121℃灭菌30min，备用。

（2）制备保护剂

液氮保藏一般都要添加保护剂，如保藏噬菌体时，要按菌体与保护剂1:1比例的20%脱脂乳为保护剂；保藏细菌等，则用10%（V/V）甘油蒸馏水或10%（V/V）二甲亚砜（DMSO）蒸馏水溶液为保护剂。如做冻结琼脂片用时，先在每个安瓿管中各加0.8mL的保护剂，于121℃灭菌30min后备用。

（3）制备菌悬液

把单细胞微生物接种到合适的培养基上，并在合适的温度下培养到稳定期，对于产生孢子的微生物应培养到形成成熟孢子的时期，再吸取适量无菌生理盐水于斜面菌种管内，用接种环将菌苔从斜面上轻轻地刮下，制成均匀的悬液。

（4）加保护剂

吸取上述菌液2mL于无菌试管中，再加入2mL20%甘油或10%DMSO，充分混匀，保护剂的最终浓度分别为10%或5%。

（5）分装菌液

将加有保护剂的菌液分装到安瓿管中，每管装0.5mL。对不产孢子的丝状真菌，在作平板培养后，可用直径0.5mm的无菌打孔器将平板上的菌丝连同培养基打下若干个圆菌块，然后用无菌镊子挑2～3块至含有1mL10%甘油或5%DMSO的安瓿管中，如放于液氮液相中保藏，安瓿管口必须用火焰密封，以免液氮进入管内。熔封后将安瓿管浸入次甲蓝溶液中于4～8℃静置30min，观察溶液是否进入管内，只有经密封检验合格者，才可进行冻结。

（6）冻结

适于慢速冻结的菌种在控速冻结器的控制下使样品每分钟下降1或2℃，当冻结到－40℃后，立即将安瓿管放入液氮冰箱中进行超低温冻结。如果没有控速冻结器，可在低温冰箱中进行。将低温冰箱调至－45℃后，将安瓿管放低温冰箱中冻结1h再放入液氮冰箱中保藏。适于快速冻结的菌种，可将安瓿管直接放液氮冰箱进行超低温冻结保藏。

（7）保藏

液氮超低温保藏菌种，可放在气相或液相中保藏。气相保藏，即将安瓿管放在液氮冰箱中液氮液面上方的气相（－150℃）中保藏。液相保藏，即将安瓿管放入提桶内，再放液氮（－196℃）中保藏。

（8）解冻恢复培养

将安瓿管从液氮冰箱中取出，立即放入38℃水浴中解冻。由于安瓿瓶内样品少，约3min即可融化。如果测定保藏后的存活率，可吸取0.1mL融化的悬液，作定量稀释后进行平板计数，然后与冻结前计数比较，即可求存活率。

4）注意事项

①放在液相保藏的安瓿管，管口务必熔封严密。否则当该安瓿管从液氮冰箱中取出时，会因进入其中的液氮受外界较高温度的影响而急剧气化、膨胀导致安瓿管爆炸。

②从液氮冰箱取安瓿管时，面部必须戴好防护罩，戴好皮手套，以防冻伤。

③当从液氮冰箱取出某一安瓿管时，为了防止其他安瓿管升温而不利于保藏，取出及放回安瓿管的时间一般不要超过1min。

5）实训结论

将实训结果记录于下表中。

表5.4　菌种保藏结果记录