微生物的菌种保藏

微生物的菌种保藏_现代微生物学实验

实验十五　微生物的菌种保藏

在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。

微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼、生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥—载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。

无论采用哪种菌种保藏法，在进行菌种保藏之前都必须设法保证它是典型的纯培养物，在保藏的过程中则要进行严格的管理和检查。

一、甘油保藏法

（一）实验目的

（1）了解甘油法保藏微生物菌种的原理。

（2）掌握甘油法保藏微生物菌种的方法。

（二）实验原理

甘油保藏法是在新鲜培养物种的液体中加入40%左右的灭菌甘油，然后置于－20℃或－70℃冰箱中保存。由于菌种在冷冻和冻融过程中会造成对细胞的损伤，而在适当浓度的甘油中，将会有少量甘油分子渗入细胞，使菌种细胞在冷冻过程中缓解了由于强烈脱水及胞内形成冰晶而引起的破坏作用，从而可以减少冻、融过程中对细胞原生质及细胞膜的损伤。而且，在－20℃或－70℃的低温下，可大大降低细胞的代谢水平，延长菌种的保藏时间。

该方法操作简便，不需要特殊设备，保藏效果较好。适用于实验室普通菌种或特殊菌种（含质粒菌种）的中、长期菌种保藏，一般可保存3～5年。

（三）实验器材

1．菌种

大肠杆菌（Escherichila coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2．培养基

牛肉膏蛋白胨培养基。

3．器皿

螺口盖试管、Eppendorf管、接种环、无菌滴管、无菌移液管、低温冰箱（－20℃或－70℃）。

4．试剂及溶液

无菌生理盐水、80%无菌甘油。

（四）实验步骤

1．无菌甘油的制备

将80%无菌甘油置于三角瓶内，塞上试管塞，外加牛皮纸包扎，高压蒸汽灭菌后备用。

2．保藏培养物的制备

（1）菌种活化：将待保藏菌种在斜面上传代活化1～2代。

（2）菌种纯化：将活化后的斜面菌种在相应的平板培养基上作划线分离、培养，并挑选最典型的单菌落移接斜面后进行适温培养，再作菌种性能检测。

（3）性能检测：对已纯化的菌种作各种典型特征的检测。

（4）菌种培养物的制备：接种上述待保存菌种作斜面、平板划线或液体接种，适温下进行培养，获得对数生长期的培养物。

3．保藏菌悬液的制备

（1）液体法

①菌液制备：将菌种培养液离心（4 000rpm），倾去上清液，并用相应的新鲜培养液制备成一定浓度的菌悬液（108～109／mL）。然后用无菌移液管吸取1．5mL，置于一支带有螺口密封圈盖的无菌试管或无菌Eppendorf管中（如用Eppendorf管则菌液加0．5mL）。

②滴加甘油：再加入1．5mL灭菌80%甘油，使甘油浓度为40%左右为宜，旋紧管盖或塞紧Eppendorf管（加0．5mL甘油）的盖子。

③振荡混匀：振荡密封的菌种小试管或Eppendorf管，使培养液与甘油充分混匀。

（2）菌苔法

①菌悬液制备：培养适龄斜面或平板菌苔作甘油菌种保存用。用生理盐水洗下菌苔细胞制成一定浓度（108～109／mL）菌悬液。

②滴加甘油：加等量甘油混匀，制备成含40%左右甘油的菌悬液。

4．甘油管的保存

（1）低温保存：上述制备好的甘油菌悬液可在－20℃左右的低温下保藏（此温度下40%的甘油菌悬液不会冻结）。

（2）超低温保存：将上述制备好的甘油菌悬液管置于乙醇—干冰或液氮中速冻，然后置于－70℃以下保藏，此法可延长保存期限。

5．菌种保藏期限的检测

（1）取菌样：在保藏期间可用无菌接种环蘸取甘油菌悬液（或刮取超低温冰箱保藏的甘油菌的冻结物），迅速盖好菌种管返回冰箱，切忌将菌种管放置在室温下，否则会加速细胞的死亡。

（2）接种斜面：将蘸取的甘油菌悬液（冻结物）接种到对应的斜面培养基上，适温培养后判断各菌种的保藏情况。

（3）再保藏制备：用接种环挑取斜面上已长好的细菌培养物，置于装有2mL相应培养液的试管中，再加入等量灭菌的80%甘油，振荡混匀后再分装菌种管。

（4）分装菌种管：将上述甘油菌悬液分装于灭菌的具螺口密封圈盖的试管或无菌Eppendorf管中，按上述直接低温保存或速冻后作超低温长期保存。

二、砂土管保藏法

（一）实验目的

掌握砂土管保藏法的原理和方法。

（二）实验原理

砂土管保藏法是一种载体保藏法，其菌种保藏的基本原理是干燥，即将微生物赖以生存的水分蒸发掉，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较长期保藏菌种的目的。为了扩大水分的蒸发面，通常将微生物的细胞或孢子吸附于砂土、明胶、硅胶、滤纸等不同的载体上，进行干燥，然后加以保存。在低温条件下，其保存期可达数年至十几年之久。砂土保藏法适用于保藏产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，在抗生素工业生产中应用最广、效果亦好，但在营养细胞应用效果不佳。

（三）实验器材

1．菌种

灰色链霉菌（Streptomyces griseus）、黑曲霉（Aspergillus niger）。

2．器皿

干燥器、试管、移液管、无菌培养皿（内放一张圆形的滤纸片）等。

3．试剂

10%HCl、五氧化二磷、石蜡、白色硅胶等。

（四）实验步骤

（1）处理砂土：取河砂经60目筛子过筛，除去大的颗粒，再用10%盐酸浸泡（用量以浸没砂面为度）2～4h（或煮沸30min），以去除其中的有机质。倾去盐酸，用流水冲洗至中性，烘干（或晒干）备用。另取非耕作层瘦黄土（不含有机质）风干，粉碎，用100～120目的筛子过筛，备用。

（2）装砂土管：将砂与土按2∶1或4∶1（根据需要而用其他比例，甚至可全部用砂或全部用土）掺和均匀，装入10mm2×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上试管塞，进行灭菌（121℃，30min）。灭菌后需抽样进行无菌检查，每10支砂土管抽1支，用接种环提取少许砂土于牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养48h，确证无菌生长后方可使用。

（3）制备菌液：选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，吸取3mL无菌水加入试管斜面，用接种环轻轻搅动，洗下孢子，制成孢子悬液。

（4）加孢子液：于每支砂土管中加入约0．5mL（一般以刚刚使砂土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。也可用接种环挑3～4环干孢子直接拌入砂土管中。

（5）干燥：把含菌的砂土管放入真空干燥器内，干燥器内放一培养皿，内盛五氧化二磷作为干燥剂，然后用真空泵抽气3～4h，以加速干燥。

（6）砂土管菌种的检查：每10支抽取1支，用接种环取出少数砂粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的砂土管有问题，尚须进一步抽样检查。

（7）保藏：砂土管可选择以下方法之一进行保藏：①保存于干燥器中；②砂土管用火焰融封后保藏；③将砂土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管内，大试管塞上橡皮塞并用蜡封管口，然后置4℃冰箱保藏。

（8）恢复培养：需要使用菌种时，取少许含菌的砂土接入斜面培养基，置合适的温度下进行培养即可。原砂土管仍可按原法继续保存。

三、冷冻干燥保藏法

（一）实验目的

了解冷冻真空干燥法保藏菌种的原理，学会冷冻真空干燥法保藏菌种的方法。

（二）实验原理

冷冻真空干燥法是菌种保藏方法中最有效的方法之一，该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种有利条件，使微生物的代谢处于相对静止状态。该法可用于细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌及病毒的保藏，具有保藏菌种范围广、保藏时间长（一般可达10～20年）、存活率高等特点，但设备和操作较复杂。

（三）实验器材

（1）菌种：待保藏的细菌、放线菌、酵母菌或霉菌。

（2）培养基：适于待保藏菌种的各种斜面培养基。

（3）器皿：安瓿管、长颈滴管、移液管。

（5）仪器：冷冻真空干燥机。

（四）实验步骤

1．准备安瓿管

用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴形安瓿管，大小要求外径6～7．5mm，长105mm，球部直径9～11mm，壁厚0．6～1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。安瓿管先用2% HCl浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，烘干。将写有菌名和日期的标签置于安瓿管内，有字的一面朝向管壁，管口加入试管塞后用牛皮纸包扎，121℃下高压灭菌30min，备用。

2．保护剂的选择和准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度、pH值以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂。脱脂牛奶制备方法：将新鲜牛奶煮沸，而后将装有该牛奶的容器置于冷水中，待脂肪漂浮于液面成层时，除去上层油脂；然后将此牛奶离心15min（3 000rpm，4℃），再除去上层油脂。如选用脱脂奶粉，可直接配成20%乳液，然后分装，灭菌（112℃灭菌30min），并做无菌试验。

3．制备菌悬液

用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24～48h的培养物；酵母需培养3d；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7～10d。

以细菌斜面为例，吸取2～3mL无菌脱脂牛乳加入斜面试管中，然后用接种环轻轻刮下培养物，再用手搓动试管，制成均匀的细胞悬液，一般要求制成的菌液浓度达108～109／mL为宜。

4．分装菌液

用无菌长颈滴管将上述菌液分装于安瓿管底部，每支安瓿管分装0．2mL（如采用离心式冷冻真空干燥机，每管0．1mL），塞上棉花。分装菌液时注意不要将菌液粘在管壁上。

5．菌液预冻

将装有菌液的安瓿管置于低温冰箱中（－45～－35℃）或冷冻真空干燥机的冷凝器室中，冻结1h。

6．冷冻真空干燥

（1）初步干燥：启动冷冻真空干燥机制冷系统，当温度下降到－45℃时，将装有已冻结菌液的安瓿管迅速置于冷冻真空干燥机钟罩内，开动真空泵进行真空干燥。如采用简易冷冻真空干燥装置时，应在开动真空泵后15min内使真空度达到66．7Pa以下，在此条件下，被冻结的菌液开始升华。继续抽真空，当真空度达到13．3～26．7Pa后，维持6～8h。此时样品呈白色酥丸状，并从安瓿管内壁脱落，可认为已初步干燥了。

（2）取出安瓿管：先关闭真空泵，再关制冷机，然后打开进气阀，使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出安瓿管。

（3）第二次干燥：将上述安瓿管近顶部塞有棉花的下端用火焰烧熔并拉成细颈，再将安瓿管装在该机的多歧管上，启动真空泵，室温抽真空，干燥时间应根据安瓿管的数量、保护剂的性质和菌液的装量而定，一般为2～4h。

7．封管

样品干燥后，继续抽真空达1．33Pa时，将安瓿管细颈处用火焰烧灼、熔封。

8．真空度检测

熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。将发生器产生火花触及安瓿管的上端（切勿直射菌种），使管内真空放电。如安瓿管内发出淡蓝色或淡紫色电光，说明管内真空度符合要求。

9．保藏

将上述符合真空度要求的安瓿管置于4℃冰箱保藏。

10．恢复培养

先用75%乙醇消毒安瓿管外壁，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，在烧热处滴几滴无菌水，使管壁产生裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中慢慢进入管内，然后将裂口端敲断，这样可防止因突然开口空气冲入管内使菌粉飞扬。再将少量合适培养液加入安瓿管中，使干菌粉充分溶解，后用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，也可用无菌接种环提取少许干菌粉至合适培养基中，置适当的温度下进行培养。

附：简易冷冻真空干燥法

冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，以下介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

（1）预冻：将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达－70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4～5min，即可使悬液结冰。

（2）真空干燥：为使样品在真空干燥时保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至－15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。

抽气一般若在30min内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa，保持压力6～8h即可。

（3）封口：抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10min即可达到26．7Pa。于真空状态下，以酒精喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

四、思考题

（1）简述甘油保藏法、砂土管保藏法和冷冻干燥保藏法保藏菌种的原理，并指明其适用保藏的微生物类型。

（2）一般微生物实验室常采用什么菌种保藏方法？

参考文献

［1］周德庆．微生物学实验教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2006．

［2］沈萍，陈向东．微生物学实验［M］．4版．北京：高等教育出版社，2008．