发酵工业微生物菌种的保藏

任务3　发酵工业微生物菌种的保藏

在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。

一、菌种保藏的原理

菌种保藏的目的在于提高菌种的存活率，减少变异，尽量保持菌种原来的优良性能。微生物菌种保藏的技术很多，原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是休眠体，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的环境中。当需要使用所保藏的菌种时，可通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。

二、菌种保藏的方法

微生物种类繁多，保藏的难易程度、保藏期限不同，所以微生物菌种的保藏方法多样，各有优缺点，因此，在选择微生物菌种的保藏方法时，既要考虑使原菌种优良性状不发生改变，也要考虑方法的通用性和操作的简便性。下面简述一些发酵生产中常用的菌种保藏方法。

1．斜面低温保藏法

斜面低温保藏法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中培养或穿刺培养，然后在低温条件下保存。此法简单易行，且不需要任何特殊的设备，可用于实验室中各类微生物的保藏。但此法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3～6个月。如放线菌于4～6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4～6℃保存，每4～6个月移接一次；霉菌于4～6℃保存，每6个月移接一次。

2．矿物油浸没保藏法

此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏，特别对难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。矿物油浸没保藏法是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中，于室温下或冰箱中保藏。操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1～2 h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1～2年。以液体石蜡保藏时，应对需保藏的菌株预先做试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感，这样的菌株都不能用液体石蜡保藏。为保险起见，用此法保藏菌株一般2～3年也应做一次存活试验。

3．真空冷冻干燥保藏法

真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期，一般培养放线菌和丝状真菌需7～10d，培养细菌需24～28h，培养酵母约需3d；然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为109～1019个／mL；取0．1～0．2mL菌悬液置于安瓿瓶中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%～5%，使培养物干燥；最后将管口熔封，在常温下保存或保存在冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冷冻干燥状态下保藏10年之久而不丧失活力，而且经冷冻干燥后的菌株无须进行冷冻保藏，便于运输。真空冷冻干燥保藏法操作过程复杂，并要求一定的设备条件。

4．干燥－载体保藏法

此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。干燥－载体保藏法是将菌种接种于适当的载体上，如河沙、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。其中以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河沙经24目过筛后用10%～20%盐酸浸泡3～4h，以除去其中所含的有机物，用水漂洗至中性，烘干，然后将高度约1cm的河沙装入小试管中，121℃间歇灭菌3次。用无菌吸管将孢子悬液滴入沙粒小管中，经真空干燥8h，于常温或低温下保藏均可，保存期为1～10年。土壤保藏以土壤代替沙粒，不需酸洗，经风干、粉碎，然后同法过筛、灭菌即可。一般细菌芽孢常用沙土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。

5．冷冻保藏法

冷冻保藏是指将菌种于－20℃以下保藏，是保藏微生物菌种非常有效的方法。此法通过冷冻使微生物代谢活动停止，一般而言，冷冻温度越低，效果越好。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂，同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。

（1）普通冷冻保藏技术（－20℃）

将菌种在小的试管中或培养瓶斜面上培养，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中储藏，或于温度范围在－20～－5℃的普通冰箱中保存。将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别转入试管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持部分微生物的活力1～2年。应注意的是，经过一次解冻的菌株培养物不宜再保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。

（2）超低温冷冻保藏技术

要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在－60℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20%甘油或10%二甲亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻管或安瓿瓶中，于－70℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1～2℃／min。部分细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。

（3）液氮冷冻保藏技术

近年来，科学家们发现大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高，且回复突变的发生率极低。因此，液氮保藏已成为工业微生物菌种保藏的最好方法。具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮（－196℃）或其蒸汽相中（－156℃）保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制制冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种时，先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0．5～1mL入玻璃安瓿瓶或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿瓶用酒精喷灯封口。然后以1．2℃／min的制冷速度降温，直到温度达到细胞冻结点（通常为－30℃）。待细胞冻结后，将制冷速度降为1℃／min，直到温度达到－50℃，将安瓿瓶迅速移入液氮罐中于液相（－196℃）或气相（－156℃）中保存。如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿瓶或液氮瓶置于－70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度甘油一般为10%、二甲亚砜一般为5%。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

6．基因工程菌的保藏

随着基因工程的不断发展，越来越多的基因工程菌需要得到合适的保藏，这是因为它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定，且其外源质粒复制子很容易丢失。另外，对于宿主细胞来说，质粒基因通常为生长非必需，一般情况下，当丢失这些质粒时，细胞生长速度会加快，而由质粒编码的抗生素抗性有利于富集含此类质粒的细胞群体。当向培养基中加入抗生素时，即对携带质粒的细胞群体提供了极为有利的生长条件。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。由此看来，基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。

三、菌种的退化与复壮

1．菌种的退化现象

随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。变异有正变异（自发突变）和负变异两种，其中负变异即菌株生产性能的劣化或有些遗传标记的丢失，又称为菌种的退化。但是在生产实践中，必须将由于培养条件的改变导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。因为优良菌株的生产性能是和发酵工艺条件紧密相关的，若培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。温度、pH的变化也会使发酵产量发生波动等。但只要条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。

常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变，如菌落颜色的改变、畸形细胞的出现等；菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失，例如放线菌、霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；菌种代谢产物的生产能力或其对宿主的寄生能力明显下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素发酵单位的减少，枯草芽孢杆菌产淀粉酶能力的衰退等。所有这些都对发酵生产不利。因此，为了使菌种的优良性状延续下去，必须做好菌种的复壮工作，即在各菌种的优良性状没有退化之前，定期进行纯种分离和性能测定。

2．菌种退化的原因

菌种退化的主要原因是相关基因发生了负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施而是一味移种传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后占优势，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。同时，对某一菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的概率比处于休眠状态的细胞大得多，因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化。

3．防止退化的措施

（1）合理的育种

选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少回复突变；在诱变处理后进行充分的后培养及纯化突变，以保证保藏菌种纯粹。这些都可有效地防止菌种的退化。

（2）选用合适的培养基

有人发现用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌——细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌——藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5－核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。也可选取营养相对贫乏的培养基作为菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化概率。

（3）创造良好的培养条件

在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。在栖土曲霉3．942的培养中，有人曾用改变培养温度的措施（从20～30℃提高到33～34℃）来防止其产孢子能力的退化。

（4）控制传代次数

由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生的，所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的概率。菌种传代次数越多，产生突变的概率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其他的保藏方式（真空冷冻干燥保藏、沙土管保藏、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。

（5）利用不同类型的细胞进行移种传代

在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其细胞中常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退的现象，而孢子一般是单核的，用它接种时就没有这种现象发生。有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地蘸取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。

4．退化菌种的复壮

退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法来实现，其中一种是从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以恢复菌种原有的典型性状。另一种是在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以使菌种的生产性能逐步提高。所以这实际上是一种利用自发突变不断从生产中进行选种的工作。

具体的菌种的复壮措施如下。

（1）纯种分离

采用平板划线分离法、平板稀释法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。

（2）通过宿主进行复壮

寄生型微生物的退化菌株可接种到相应宿主体内以提高菌株的活力。

（3）联合复壮

对退化菌株还可用高剂量的紫外线辐射和低剂量的DTG联合处理进行复壮。