海洋微生物发酵工程的工艺控制

海洋微生物与陆生微生物相比，在营养需求和环境条件方面存在一定的特质性，具体特征在本书第一章已有所阐述。发酵过程中，发酵条件既能影响微生物的生长，又能影响代谢产物的形成。因此，研究生产菌种所需的最佳发酵工艺条件，并以此为依据进行发酵工艺控制，将会有效地提高发酵水平。

1.基质对发酵的影响及其控制

对于发酵控制来说，基质是生产菌代谢的物质基础，涉及菌体的生长繁殖和代谢产物的形成。因此，选择适当的基质和控制其适当的浓度是提高代谢产物产量的重要方法。基质对发酵的影响主要从碳源、氮源、无机盐和微量元素等方面发挥作用。

（1）碳源。

碳素是构成菌体的主要元素，也是细胞贮藏物质和产生多种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动能量的主要来源。目前工业发酵菌种大都为异养型微生物，只能利用有机碳，如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、小麦粉、粗粒度大豆等。有些菌种当碳源浓度过高时，代谢产物会对发酵生产有阻遏作用，可采用流加法使碳源浓度保持在较低水平以防止阻遏作用的发生。

（2）氮源。

氮素是生物体内的各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸和核酸等成分。微生物产生蛋白酶的有机氮源有酪蛋白、酪蛋白氨基酸（casamino acid）、明胶、豆饼粉、蛋白胨、大豆粉等，无机氮源有NH4Cl、NaNO3等。微生物不同，其适宜的氮源种类和浓度也不同。如黄海黄杆菌Flavobacterium sp.在只用无机氮源的培养基上，海洋低温蛋白酶合成几乎不能进行，有机氮源（豆饼粉）对蛋白酶生产有促进作用。而NaNO3是普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）产生碱性蛋白酶的理想氮源，有机氮源如胰蛋白胨、酪蛋白等反而对该菌酶的产生有抑制作用。

（3）无机盐。

2.环境条件对发酵的影响及其控制

环境条件主要包括发酵温度、pH、溶解氧、二氧化碳、泡沫等。

（1）温度。

在影响和控制发酵的多种因素中，最先考虑的就是温度对发酵过程的影响。温度对发酵过程的影响是多方面的，它会影响酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外，温度还对发酵液的理化性质产生影响。理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根据发酵的不同阶段，选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。

黄海黄杆菌YS-9412-130产低温碱性蛋白酶的发酵温度为18℃，克劳氏芽孢杆菌I-52为37℃。发酵温度的变化主要随微生物代谢反应，发酵中通风、搅拌速度的变化而变化。在发酵过程中，微生物不断吸收培养基中的营养物质合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应；当菌体生长时营养物质被大量分解，分解代谢的生化反应都是放热反应。发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，情况相反，发酵液温度就自行上升，加上因通风而带入的热量和搅拌所产生的机械热，这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。

（2）pH。

不同种类的微生物对pH的要求不同，大多数细菌的最适pH为6.5～7.5，海洋异养菌培养基的pH通常为7.6，霉菌的最适pH一般为4～5.8，酵母菌的pH一般为3.8～6。发酵液的pH变化对菌体的生长繁殖和产物的积累影响极大，所以在工业发酵中，维持最适pH是生产成败的关键因素之一。既有利于菌体的生长繁殖，又可最大限度地获得高产量的产物是选择最适pH的原则。

产酶微生物生产的合适pH通常和酶反应的最适合pH相接近。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，同时排出代谢产物，使发酵液中的pH不断变化。生产上pH的变化情况常作为生产控制的根据。一般来说，培养基中的碳 / 氮（C/N）比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性，pH高。培养基中的糖和脂肪被分解和同化时的氧化程度直接影响pH，如通气量大，糖和脂得到完全氧化，产生CO2和H2O；如果通气量不足，糖和脂氧化不完全，则产物为中间产物有机酸，使培养基中pH出现不同程度的降低。在碳源严重不足，微生物被迫利用氨基酸的碳架，留下—NH3，pH也可能上升。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节培养基的起始pH，保持一定的C/N比；当发酵液pH过高时添加糖或淀粉来调节，pH过低时用通氨或加大通气量来调节。

（3）通风量和搅拌。

对于好氧发酵，溶解氧浓度是重要的参数之一。好氧微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。要维持一定的溶氧水平，需从供氧和需氧两方面着手。

发酵工业中，通风量以VVM来表示，即单位时间内（min）通过单位体积（m3）发酵液的空气体积（m3）。如0.5VVM表示每分钟每立方米发酵液供给0.5m3的空气，也可用通气量1:0.5来表示。发酵过程中，通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然年轻细胞呼吸强度大，需氧多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁殖旺盛时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。菌种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。

深层发酵时，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。搅拌可把通入的空气打碎成小泡，因而增加气液接触的有效界面，加速氧的溶解速度。搅拌能使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生切应力，易使细胞受损。同时搅拌带来一定机械热，易使发酵温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。

二氧化碳的浓度视其对发酵的影响而定。如果对发酵有促进作用，就应该提高其浓度；如果对发酵有抑制作用，就应该降低其浓度。

（4）泡沫的影响。

在大多数微生物的发酵过程中，在通气条件下培养液中会形成泡沫，这是由于发酵液受到强烈的通气搅拌和培养基中某些成分的变化以及代谢产生的气体所形成的。发酵过程中产生少量泡沫是正常的，过多的泡沫则会降低发酵罐的装料系数和氧传递系数，阻碍了CO2的排出，影响氧的溶解，同时影响添料，也易使发酵液溢出罐外，甚至导致代谢异常或菌体自溶。

因此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械消泡外，还可利用消泡剂。消泡剂消泡的机理有两个方面，一是加入消泡剂后，可降低泡沫的表面张力，使泡沫破裂；二是改变电荷性质，降低泡沫的机械强度。消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮等，其中聚甲基硅氧烷效果最好。我国常用天然油类、甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）或泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚）。理想的消泡剂，其表面相互作用力应较低，而且应难溶于水，还不能影响氧的传递效率和微生物的正常代谢。在酶生产中一般随菌体生长繁殖旺盛和酶的积累而泡沫增多，因此消泡剂的强度应根据泡沫上升程度而定。通常发酵罐内消泡剂的消泡作用不能控制泡沫上升时就应及时添加，消泡剂的添加以勤加、少加效果较好，不宜一次大量添加，如果添加过量，不仅抑制菌体生长和产酶，还影响酶制剂的提取。

3.发酵终点的判断

微生物发酵终点的判断对提高产物产量和经济效益影响很大。生产能力是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量。生产过程中既要考虑生产率，又要考虑产品的成本问题。确定合理的放罐时间，需要考虑以下因素。

（1）经济因素。

发酵时间的确定应以最低的成本获得最大的产量为依据。在实际生产中，缩短发酵周期有利于提高设备利用率。因此，要从经济学角度确定一个合理的放罐时间。

（2）产品质量因素。

发酵时间对后续工艺和产品质量有很大影响。发酵时间过短，会有很多未代谢的营养物质残留在发酵液中，对产品的分离、提纯等工序不利。而发酵时间过长，菌体会自溶，导致发酵液的性质改变，扰乱产物的提取。因此，要考虑发酵周期长短对提取因素的影响。

（3）特殊因素。

微生物发酵过程中有时需要考虑一些特殊因素。在染菌、代谢异常等情况下，就要根据实际情况进行适当处理。有时为了得到尽量多的产物，应适当提前或延后放罐时间。