菌种培养保藏技术与机械设备

（四）菌种培养保藏技术与机械设备

1.菌种的培养技术与设备

（1）菌种培养的技术要求

图18　接种机

1.瓶夹　2.菌刀　3.瓶夹座板　4.接种盘　5.操纵杆　6.挖种行程开关　7.杀菌灯　8.复位开关　9.点动开关　10.杀菌灯开关　11.菌量调节旋钮　12.保险丝　13.照明开关　14.电源开关　15.电源线

①把接好菌种的母种试管、原种瓶或栽培种袋移入培养室培养。菌种瓶初放时，应直立于床架上，当菌丝吃料后，可将其横放。

②培养室要提前清扫消毒，地板、培养架冲洗干净后，用5%来苏儿或漂白粉对水后喷洒一遍，最后每10平方米空间用40克高锰酸钾加100毫升甲醛熏蒸。

③培养室要保持干燥、通风，遮光培养，温度控制在15～ 25℃。培养过程中，要经常检查，发现污染（出现黄青色斑或散落的白菌群）要及时转移处理。培养第一周每天检查1次，以后每周检查1次，直至菌丝长满。一般母种需培养15～20天，原种和栽培种需培养20～30天。

（2）培养设备培养设备主要指接种后用于培养菌丝的设备，如恒温箱、恒温恒湿生化培养箱、空调等。

①培养室培养室是培养菌种的房间。室的大小和数量可根据生产的规模而定。每间不宜过大，以培养5000瓶（袋）为宜。室外最好有一缓冲过道。培养室要求干净、通风、光线暗、干燥、保温，室内放置菌种架。菌种架用木架、竹架或铁架均可，以4～6层较合适。培养室的地面，以水泥地为好，便于刷洗和清扫。在寒冷地区，培养室的墙壁应有夹层，中间填塞木屑、谷壳、蛭石、玻璃纤维或泡沫塑料等保温材料。室内用电炉、暖气片或火墙供热，门口挂棉门帘保温。控温仪与电炉配套使用以保持温度的恒定。用干湿球温度计检测温度和湿度。

②培养箱培养箱（图19）用于斜面试管菌种的培养，大型培养箱有时也用于原种的培养。它的温度一般在20～40℃之间可以任意调节。电热恒温培养箱是经电热器加热箱内空气，并由自动控制器调节不同温度，使箱内达到恒温的装置。由于价格昂贵，可以自己制作。用双层木板中间（50毫米）装木屑，做成45厘米×45厘米×70厘米的箱体，共分3层，上2层各高25厘米，安放木条供搁放托盘；箱底为加热层，装上石棉板，绕上电热丝制成加热装置，也可安装1只60瓦白炽灯泡加热；下面一层盘架上可垫1块白铁皮或硬纸板遮挡光线；箱顶中央留1个小孔，放入1支套有橡皮塞的温度计；在箱的右侧上方安装自动控温仪、旋钮和刻度盘以及电源开关；箱门双层，上部装1小块玻璃供观察用。

③生化培养箱主要由加热电炉丝、风扇、制冷设备、培养箱和控温设备组成，由于有制冷设备，因此控制温度范围较大，而且温度恒定，可达10～60℃，不管冬天或夏天均可使用。有些生化培养箱增加保温系统，成为恒温恒湿培养箱。

④空调培养室其主要设备为空调系统和培养架，空调系统有两种形式，一种为集中式空调（也称中央空调），特点是空气处理设备集中在空气处理室内，处理后的空气用风道送到各空调房间，便于集中管理、维护。空气处理包括对空气进行过滤净化、加热、冷却、加湿和减湿等各种处理和通风机设备。另一种为局部式空调，常用为冷暖型窗式空调，来控制培养室的温度，达到菌种生长的最适温度。

图19　培养箱

1.温度计　2.膨胀片温度自动调节器　3.微分开关　4.膨胀片　5.木屑或谷壳

⑤培养室消毒设备常用有紫外灯、臭氧发生器、电子灭菌消毒器、空气净化器和空气自净器等几种设备。其中臭氧发生器和电子灭菌消毒器均是由设备产生臭氧进行氧化杀菌，而空气自净器是通过空气不断过滤，除去杂菌，达到灭菌目的。

2.菌种的保藏技术与设备

菌种在生产季节过后，需要保存妥善，以便下一个生产季节使用。在夏季的室温中，各种食用菌的母种、原种和栽培种，接种后可在1个月内长好，若不再接种或用于生产，则很快败坏。一般采用低温、干燥和减少氧气的方法保藏。

（1）菌种保藏的目的菌种保藏的主要目的在于能在较长时间内保持菌种的生存；保存菌种在遗传上、形态上和生理上的稳定性。菌种保藏还可保持其优良种性，有效地延长优良品种使用的年限。为了达到上述目的，菌种在保藏前，必须种性清楚、来源正宗、名称正确，并具有整套有关技术数据和资料，并处于良好状态。应用适当的保藏技术和方法，保藏后的菌种会出现最好的生长状况和正常的外观形态，栽培后会表现出原有的优良性状。但是，如果保藏入库前菌种本身不合质量标准、性状不佳、生长不良，不可能通过保藏而改善。因此，专业的菌种保藏机构菌种保藏效果如何，种源至关重要。

（2）菌种保藏方法与设备

①液氮保藏这是专业菌种保藏部门的专业菌种保藏方法，从理论上讲，该方法可无限期地保藏菌种。其原理是采用超低温手段，使菌种处于－150～－196℃液态氮超低温冰箱中保存，在这样的温度下，生物的一切生命活动都处于停止状态。在此条件下保藏，能保持其性状基本上不发生变异。目前，液氮保藏菌种是世界公认的最好的方法，但它受条件设施的限制，只有专业菌种保藏机构才可实施。这一方法需昂贵的设备和日常消耗费用，需有固定的财力支持。液氮罐的外形及罐内结构如图20所示。

液氮保藏的方法步骤如下：

第一，菌种制备。采用马铃薯葡萄糖酵母琼脂培养基（PDYA）。配比：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，酵母膏1.5克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。菌丝体菌种可用试管斜面或平板法培养菌丝体，也可用麦粒菌种或液体培养的菌丝球进行保藏。孢子菌种采用常规方法收集孢子，然后制成孢子悬浮液保藏。

第二，保护剂。冷冻保护剂可用10%（体积比）甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液。

第三，装安瓿管封存。制作安瓿管的玻璃要求能经受温度突变而不破裂，并且容易用火熔封管口且恢复培养时容易打开的，一般采用硼硅玻璃。安瓿管的大小可根据需要选用，容量有1毫升、1.8毫升、3.6毫升、4.5毫升。安瓿管准备好以后，每管加入0.8毫升保护剂，塞上棉塞，在0.098兆帕（1千克/平方厘米）的压力下灭菌15分钟。无菌操作接入要保藏的菌种，火焰熔封管口，采用浸水法检查是否漏气。

第四，冻结保藏。将封好的安瓿管放在慢速冻结器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至－35℃，以后冻结速度就不需控制。安瓿管冻结后立即放入液氮罐内，罐内的气相温度为－150℃，液相温度为－196℃。

图20　液氮罐结构

1．把手　2．断热盖　3．贮藏槽　4．液体氮气槽

第五，复苏培养。要使用保藏的菌种时，将安瓿管从液氮罐中取出，立即放入38～40℃的水液中，待管内冻结物全部融化后打开安瓿管，将管内菌种移接到适宜的培养基上培养。

②真空冷冻干燥保藏真空冷冻干燥简称冻干。真空冷冻干燥机的结构如图21所示。这种方法是利用低温使孢子先冷冻，然后再在真空条件下，使孢子中的水分升华排出，孢子处于休眠状态，但仍保持原有活力，是一种长期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具体操作步骤如下：

第一，选用内径8毫米、长120毫米的中性玻璃管作为制安瓿管的材料。将玻管用2%盐酸浸泡8～10小时，再用蒸馏水洗2～3次后，置烘箱中烘干。将印有菌号、编号、制作日期的标签放入安瓿管中，塞好棉塞，进行干热灭菌。

第二，用接种铲将收集的蘑菇孢子铲入盛有3毫升无菌脱脂牛奶的试管中，稍加摇动，制成孢子悬浮液。用无菌吸管将孢子悬浮液移入安瓿管的球形部分，每管约0.2毫升，然后将管口通过火焰，用无菌镊子取少许无菌棉花塞于安瓿管口。

图21　真空冷冻干燥机

1.真空泵2.缓冲瓶3.麦氏真空计4.真空干燥器5.安瓿管菌种6.1：3的盐冰水

第三，将安瓿管放入无水乙醇与干冰混合的预冻装置，温度可达－65～－70℃，预冻5分钟左右，也可在低温冰箱（－40℃）预冻30～60分钟。然后取出放入真空干燥器中，用高真空活塞密封好立即抽真空，并随时用真空火花检漏仪检查真空度，发现有微小漏气处，要迅速用真空泥堵住。一般真空度应维持在10.7千帕以下，如抽真空10分钟后仍达不到此真空度，说明真空系统不佳，可能会造成融化而失败。真空干燥器外面用1：3的盐冰水保温，其效果会好些；若真空度稳定，一般抽7～8小时，可完全将安瓿管中水升华至干。此时应关闭缓冲瓶前的三道阀门，然后再断电。抽干后的安瓿管颜色应是白色，如果浅黄色或不成凹状，多数都因为真空度达不到要求而造成融化失败的结果。

第四，冻干好的安瓿管要进行真空熔封。可用一个顶端多歧管或一个Z形管，每个分支口都接入真空橡皮管以便将安瓿管接在橡皮管内，然后抽真空，边抽真空边用煤气喷灯熔封。熔封的安瓿管要进行检漏，可用高真空火花检漏仪检查。安瓿管内呈蓝色荧光，说明真空封口良好，也可用微带红或蓝的清水浸泡安瓿管，经一昼夜安瓿管内无颜色水浸入，则为封口合格。

第五，菌种安瓿管经无菌检查和存活率检查合格后，置2～ 8℃冰箱内保藏，一般蘑菇菌种可保藏8～10年。

第六，复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3～0.5毫升的无菌生理盐水或1%麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿管的封端加热，在浸有来苏儿等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。安瓿管加入生理盐水后菌种即自行溶化，摇动后即成孢子悬浮液，可接入马铃薯琼脂培养基上，进行萌发培养。