组培无菌接种与培养

2）接种

接种是组织培养过程中易于污染的一个环节，操作过程必须在无菌条件下进行。

（1）接种前的准备工作

①每次接种或继代繁殖前，应提前30min打开接种室和超净工作台上的紫外线灯进行消毒，然后打开超净工作台的风机，吹风10min。

②操作人员进入接种室前，用肥皂和清水将手洗干净，换上经过消毒的工作服和拖鞋，并戴上工作帽和口罩。

③开始接种前，用70%的酒精棉球仔细擦拭手和超净工作台面。

④准备一个灭过菌的培养皿或不锈钢盘，内放经过高压消毒的滤纸片。解剖刀、医用剪刀、镊子、解剖针等用具应预先浸在95%的酒精溶液内，置于超净工作台的右侧。每个台位至少备两把解剖刀和两把镊子，轮流使用。

⑤接种前先点燃酒精灯，然后将解剖刀、镊子、剪子等在火焰上方灼烧后，晾于架上备用。

（2）接种技术

①用镊子将植物材料夹到已高压消毒、盛有滤纸的培养皿中，在超净工作台上将外植体切成3～5mm的小段，在双筒解剖镜下剥离的茎尖分生组织大小为0．2～0．3mm，经过热处理的材料可带2～4个叶原基，切生长点长约0．5mm。

②将培养瓶倾斜拿住，打开瓶塞前，先在酒精灯火焰上方烤一下瓶口，然后打开瓶塞，并尽快将外植体接种到培养基上。注意，材料一定要嵌入培养基，而不是放在培养基上面或全部埋入培养基内。塞回瓶塞以前，再在火焰上方烤一下。

③每切一次材料，解剖刀、镊子等都要放回酒精内浸泡，并灼烧。

除上述常规操作步骤以外，对于新建的组织培养室首次使用以前，必须进行彻底的擦洗和消毒。先将所有的角落擦洗干净，然后进行熏蒸消毒（即用甲醛和高锰酸钾混合，产生大量蒸汽消毒），其后再用紫外线灯照射。

3）培养

（1）初代培养　也称诱导培养。培养基由于植物种类的不同而不同，通常是MS基本培养基加入适量的植物生长调节剂及其他成分。首先在一定温度（22～28℃）下进行暗培养，待长出愈伤组织后转入光培养。如对于赤道附近的花卉，应在恒温状态下培养；而对原产于温带的花卉，用变温培养效果更好。此阶段主要诱导芽体解除休眠，恢复生长。

（2）继代培养　也称增殖培养。将见光变绿的芽体组织从诱导培养基转接到芽丛培养基上，在每天光照12～16h、光照强度1000～2000lx条件下培养，不久即产生绿色丛生芽。将芽丛切割分离，进行继代培养，扩大繁殖，平均每月增殖一代，每代增殖5～10倍。为了防止变异或突变，通常只继代培养10～12次。根据需要，一部分进行生根培养，一部分仍继代培养。

（3）生根培养　培养基通常为1/2MS培养基加入适量的植物生长调节剂，如1/2MS＋NAA或IBA（0．1mg/L）。切取增殖培养瓶中的无根苗，接种到生根培养基上进行诱根培养。有些易生根的植物在继代培养中通常会产生不定根，可以直接将生根苗移出进行驯化培养。或者将未生根的试管苗长到3～4cm长时切下来，直接栽到蛭石为基质的苗床中进行瓶外生根，效果也非常好，省时省工，降低成本。这个阶段可筛选淘汰生长不良和感病的试管苗。

（4）驯化培养　发根的组培苗（或称试管苗）从培养瓶中移出，在温室中栽培。至植株长大发生5～6片叶为止的过程，为驯化培养阶段，这是组培苗从异养到自养的阶段。

组培苗移出前，要加强培养室的光照强度和延长光照时间，进行光照锻炼，一般进行7～10d。再打开瓶盖，让试管苗暴露在空气中锻炼1～2d，以适应外界环境条件。

移栽基质最好用透气性强的蛭石、珍珠岩与泥炭。如果栽植在土壤中，土壤应为疏松的沙壤土，或为沙土掺入少量有机质或林地的腐殖质土。用营养钵育苗，可用直径6cm的塑料营养钵。移栽时选择2～4cm、3～4片叶的健壮试管苗，将根部培养基冲洗干净，以避免微生物污染而造成幼苗根系腐烂。如果是瓶外生根，将植株基部愈伤组织去掉，用水冲洗一下，直接插入基质中。移栽后浇透水，加塑料罩或塑料薄膜保湿。

一般炼苗的最初7d，应保持90%以上的空气相对湿度，适当遮阴。7d以后适当通风降低空气相对湿度，温度保持在23～28℃。半月后去罩、掀膜，每隔10d喷一次稀释100倍的MS大量元素母液。培养4～6周后，试管苗便可转入正常管理。

4）杂菌污染的识别及其预防

当污染现象发生时，最好先根据污染情况做出判断，分清楚是细菌污染还是真菌污染，以便采取相应措施进行处理。

（1）细菌污染及其预防　在培养过程中，培养基或外植体上出现粘液状或水迹状物，有时需要仔细辨认才能看清，这是细菌污染的特征。细菌污染主要是由于培养基灭菌不够彻底，或在接种操作时没有对外植体进行彻底灭菌所致。因此，所用的培养基一定要在培养室中预培养2～3d，然后再进行检验，确定无细菌感染的迹象后再使用。为了防止因接种造成细菌感染，应对初代培养、继代培养的材料进行系统检查，发现有被细菌污染的迹象时，应立即清除。

（2）真菌污染及其预防　在接种后，培养基或外植体表面出现白、黑、绿等色的块状真菌孢子，其蔓延速度较快，为真菌污染的特征。真菌污染易通过空气、培养容器、瓶口进行，因此要加强对空气的灭菌管理。在每次操作前，最好先用紫外线灯灭菌20～30min，再用75%的酒精对容器、材料表面进行喷雾灭菌。

5）外植体的褐变及玻璃化现象

（1）外植体褐变　是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐的现象。褐变现象的发生与植物品种、外植体的生理状态（较成熟）、培养基成分（无机盐浓度过高或细胞分裂素的水平过高）和不当的培养条件（光照过强、温度过高、培养时间过长等）有关。为了防止褐变现象的发生，通常采取如下措施：

①选择合适（生长旺盛）的外植体。

②培养条件合适：如适宜的无机盐浓度与细胞分裂素水平，适宜的温度和光照，及时继代培养等。

③使用抗氧化剂。

④连续转移：对易褐变的材料培养12～24h后，即转移到新培养基上，连续转移7～10d后，褐变现象会得到控制。

（2）玻璃化　当植物材料不断进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状、呈水迹状，这种现象称为玻璃化。解决这一问题常用的方法有：

①增加培养基中的溶质水平。

②减少培养基中含氮化合物的用量。

③增加光照。

④增加通风，最好施用CO2气肥。

⑤降低培养温度，进行变温培养。

⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可考虑加入适量脱落酸。

6．2　容器苗生产

利用各种容器装入培养基质培育苗木，称为容器育苗，又叫营养钵育苗。用这种方法培育的苗木称为容器苗。

6．2．1　国内外容器苗的现状与趋势

容器苗生产是在20世纪50年代开始兴起。20世纪60年代，塑料工业的发展，为容器育苗提供了更好的容器材料，加速了容器育苗的发展。20世纪70年代，在世界各国，容器育苗得到了快速发展，并且大规模应用于生产中。我国容器育苗开始于20世纪50年代末期，近年来容器育苗已经被广泛应用于蔬菜、花卉、苗木、观赏植物等的栽培，成为集约化设施栽培的重要组成部分。

6．2．2　容器苗的特点

1）容器苗的优点

（1）在园林植物的繁殖上，既可以用容器播种育苗，又可以用容器进行扦插繁殖。

（2）由于容器育苗是在人为控制水分、养分、温度、光照、通风等条件下进行的，根系在容器内形成，发育良好，移植时可保证根系完整，起苗时不伤根，减少了因起苗、运输和假植等作业过程中对根系的损伤和水分的损失，提高了苗木移栽成活率。

（3）容器苗移植后没有缓苗期，生长快，有利于培育壮苗。

（4）容器育苗可以延长绿化植树的时间，不受植树季节的限制，便于合理安排劳动力，有计划地进行分期绿化。

（5）可以节省种子。

（6）培育时可以不占用肥力好的土地。

（7）容器育苗培育的苗木均匀、整齐，适合于机械化作业，可以提高劳动效率。

正因为容器育苗有很多优点，所以近年来国内外已将容器育苗技术与塑料大棚、温室等技术相结合，向自动控制育苗的环境条件方向发展，如自动控制气温、空气相对湿度、光照、土壤温度和湿度以及通风等。

2）容器育苗的缺点

容器育苗单位面积的产苗量低，育苗成本比裸根苗高。

6．2．3　容器苗的生产管理技术环节

1）容器的种类

选择育苗容器一般应考虑以下几点：有利于苗木生长，成本低廉，操作使用方便，保水性能好，浇水、搬运不易破碎等。

根据容器特点分为可回收的容器和不可回收的容器。

（1）可回收的容器　在土壤中不能被微生物分解，植树时要将苗木从容器中取出。如图6．1所示的各种规格的塑料容器，便是可回收的容器。常用的可回收容器有以下几种。