任务6.3微生物的无菌操作和接种技术

任务6.3　微生物的无菌操作和接种技术

用接种针或接种环分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。接种环及接种针一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金、铂金等金属设备。无菌操作是微生物接种技术的关键，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或是无菌操作室内的无菌环境下进行操作。实验室中为获得生长良好的纯种微生物常采用斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环，穿刺时用接种针，液体转接时用移液管等。

6.3.1　接种前的准备工作

无菌室的准备

在微生物实验中，一般小规模的接种操作使用无菌接种箱或超净工作台；工作量大时使用无菌室接种，要求严格的在无菌室内再结合使用超净工作台。

（1）无菌室的设计

无菌室的设计可因地制宜，但应具备下列基本条件：

无菌室要求严密、避光，隔板宜采用玻璃为佳。但为了在使用后排湿通风，应在顶部设立百叶排风窗。窗口加密封板，可以启闭，也可以在窗口用数层纱布和棉花蒙罩。无菌室侧面底部应设进气孔，最好能通入过滤的无菌空气，无菌室一般应有里外两间。较小的外间为缓冲间，以提高隔离效果。

无菌室应安装拉门，以减少空气流动，必要时，在向外一侧的玻璃隔板上安装一个双层的小型玻璃橱窗，便于内外传递物品，减少进出无菌室的次数。

室内应有照明、电热和动力用的电源。

工作台台面应抗热、抗腐蚀、便于清洗消毒。可采用橡胶板或塑料板铺敷台面。

（2）无菌室内的设备

无菌室内的里外两间均应安装日光灯和紫外线杀菌灯。紫外灯常用规格为30W，吊装在经常工作位置的上方，距离地面高度2～2.2m。

缓冲间内应设工作台供放置工作服、鞋、帽、口罩、消毒用药物、手持式喷雾器等，并备有废物桶等。

无菌室内应备有接种用的常用工具，如酒精灯、接种环、接种针、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球瓶、记号笔等。

（3）无菌室的灭菌

①熏蒸。熏蒸在无菌室全面彻底灭菌时使用。先将室内打扫干净，打开进气孔和排气窗通风干燥后，重新关闭，进行熏蒸灭菌。常用的灭菌药剂为福尔马林（含37%～40%的甲醛水溶液），按6～10mL/m³的标准计算用量，取出后，盛于铁质容器中，利用电炉或酒精灯直接加热（应能随时在室外中止热源）或加入半量高锰酸钾，通过氧化作用加热，使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上。由于甲醛气体具有较强的刺激作用，所以在使用无菌室前1～2h在一个搪瓷盘内加入与所用甲醛溶液等量的氨水，放入无菌室，使其挥发中和甲醛，以减轻刺激作用。除甲醛外，也可用乳酸、硫磺等进行熏蒸灭菌。

②紫外灯照射。在每次工作前后，均应打开紫外灯，分别照射30min，进行灭菌。在无菌室内工作时，切记要关闭紫外灯。

③石炭酸溶液喷雾。每次临操作前，用手持喷雾器喷5%石炭酸溶液，主要喷于台面和地面，兼有灭菌和防止微尘飞扬的作用。

（4）无菌室空气污染情况的检验。为了检验无菌室灭菌效果以及在操作过程中空气污染的程度。需要定期在无菌室内进行空气中杂菌的检验。一般可以在两个时间进行：一是在灭菌后使用前；二是在操作完毕后。

取牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯、蔗糖、琼脂培养基的平板各三个，于无菌室使用前（或在使用后）在无菌室内打开，放置台面上，0.5h后重新盖好。另有一份不打开的做对照。一并放在30℃下培养，48h后检验有无杂菌生长以及杂菌数量的多少。根据检验结果确定应采取的措施。

无菌室灭菌后使用前检验时，应无杂菌。如果长出杂菌多为霉菌时，表明室内湿度过大，应先通风干燥，再重新进行灭菌；如杂菌以细菌为主时，可采用乳酸熏蒸，效果较好。

（5）无菌室操作规则。将所有要用的实验器材和用品一次性全部放入无菌室（如同时放入培养基则需用牛皮纸遮盖）。应尽量避免在操作过程中进出无菌室或传递物品。操作前先打开紫外灯照射0.5h，关闭紫外灯后，再开始工作。

进入缓冲间后，应换好工作服、鞋、帽，戴上口罩，将手用消毒液清洁后，再进入工作间。

操作时严格按照无菌操作法进行操作，废物应该丢入废物桶内。

工作后应将台面收拾干净，取出培养物品及废物桶，用5%石炭酸喷雾，再打开紫外灯照射0.5h。

6.3.2　无菌操作前的处理

1）手的清洗和无菌器材的处理

关于手的清洗和无菌器材的处理，必须按照以下方法进行操作。

①进行无菌操作的环境应清洁、宽敞，空气清新，无尘埃。

②无菌操作前，操作人员要穿戴整洁，帽子须遮盖全部头发，口罩须盖住口鼻，并认真彻底洗手（图6.18）。

图6.18　洗手方法

a.手掌对手掌；

b.手背对手掌；

c.两手指缝相对互擦；

d.双手并扣互擦指背；

e.拇指在掌心旋转擦洗；

f.指尖对手掌擦洗；

g.摩擦手腕，然后彻底流水冲净。

认真揉搓双手至少15s，范围为双手、手腕及腕上10cm，注意将指尖、指缝、拇指、指关节等处清洗干净。

③实施无菌技术操作必须使用无菌物品。一次性使用的无菌医疗器械、用品不得重复使用。

④无菌物品与非无菌物品应分柜放置，并有明显标志。无菌包需标明物品名称、灭菌日期，按失效期先后顺序摆放。无菌包的有效期按7d计算，过期或受潮应重新灭菌。无菌柜应定期整理、清洁。

⑤在无菌技术操作时，必须明确无菌区和非无菌区。

⑥使用无菌物品前必须认真检查无菌包包装完整性、标志有效性，即无菌包的名称、灭菌时间或失效期、签名等，检查包内外化学指示胶带变色情况等。湿包或有明显水渍，密封容器的筛孔被打开，灭菌包掉落在地或误放不洁之处，包装破损或发霉，外包装指示带或包内指示卡变色没有达到标准或有疑问等情况，应视为污染，不能再使用。不得使用过期无菌物品。

⑦进行无菌操作时，操作者应面向无菌区域并与无菌区保持一定距离；手臂应保持在腰部或操作台面以上，操作过程中不可跨越无菌区，手不可触及无菌物。操作时不可面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。

⑧无菌物品必须一人一用一灭菌。取用无菌物品时应用无菌持物钳（镊）近距离夹取。无菌持物镊（钳）可用消毒液浸泡或干性保持。湿式无菌持物钳、筒及筒内消毒液每周更换一次，干式无菌持物筒和钳每4h更换一次，一旦污染随时更换。

⑨无菌物品取出后不可放回无菌容器内，应用无菌巾包（盖）好，超过4h不得使用。开启的无菌药液须注明时间。开启的无菌溶液须在4h内使用，其他溶液不得大于24h。注射治疗时，应用无菌盘，抽出的药液不得大于2h。

⑩用于无菌技术操作的棉球、棉签、纱布，根据一次用量的标准，独立包装。用无菌容器盛放的无菌物品，一经打开，使用时间最长不得大于24h。

皕瑏瑡消毒皮肤用的碘伏、酒精应密闭保存。病区盛放消毒溶液的容器每周灭菌2次。

2）取无菌溶液

取无菌溶液应遵循以下规则：

①首先清洁无菌溶液瓶外的灰尘。

②核对无菌溶液名称、浓度、有效期，检查溶液有无沉淀、混浊、变色，检查瓶盖有无松动，瓶身有无裂缝。

③用启瓶盖器开启瓶盖，然后用拇指与食指或双手拇指将瓶塞边缘向上翻起。

④用一食指和拇指夹住瓶塞将其拉出。

⑤用一手拿溶液瓶签朝向掌心，先倒出少许以冲洗瓶口，再由原处倒出溶液至无菌溶器中。

⑥倒毕塞进瓶塞，消毒瓶塞、瓶盖，然后盖好，未用完者需注明开启日期、时间。

3）无菌容器的使用

使用无菌容器，应遵照以下规定：

①检查无菌容器名称、灭菌日期。

②取物时，打开无菌容器盖，内面向下，用持物钳夹取无菌物品。若是在口杯类无菌容器内取物时，一手打开容器盖，一手用持物钳夹取无菌物品。

③取物后，立即将盖盖严。

④手持无菌容器时应托住容器底部，不能触及容器边缘及内面。

4）玻璃器皿的消毒和清洁

玻璃器皿分新购玻璃器皿和污染玻璃器皿，其消毒和清洁的方法是不同的。

（1）新购玻璃器皿的处理

新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。

（2）污染玻璃器皿的处理

①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30min，或在3%～5%漂白粉澄清液内4h。有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。

②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm²高压灭菌15～30min，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。

③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24h，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。

④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤。先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干0.5h，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。

⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁剂或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。

⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。

5）无菌器材和液体的准备

将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并在吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2h，取出备用。

对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20min。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用无菌滤器负压抽滤后使用。

6.3.3　无菌操作过程

在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前20～30min要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒剪刀、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。

接种工具的准备

接种工具有接种环、刮铲和移液管。

（1）接种环

最常用的接种或移植工具为接种环（图6.19）。接种环是将一段铂金丝安装在防锈的金属杆上制成。市售商品多以镍铬丝（或细电炉丝）作为铂金丝的代用品。也可用粗塑胶铜芯电线加镍铬丝自制，简便实用。注意，使用前需要灼烧灭菌（图6.21）。

图6.19　接种环

图6.20　各种接种工具

图6.21　接种环（针）灭菌方法

接种环供挑取菌苔或液体培养物接种用。环前端要求圆而闭合，否则液体不会在环内形成菌膜。根据不同用途，接种环的顶端可以改为其他形状，如接种针、接种铲等各种接种工具（图6.20）。

（2）刮铲

刮铲又称涂布棒，是稀释平板涂抹法进行菌种分离或微生物计数时常用的工具，最常用的有玻璃刮铲（图6.22）和不锈钢刮铲（图6.23）。如将定量（一般为0.1mL）菌悬液置于平板表面涂布均匀的操作过程就需要用玻璃刮铲完成。

用一段长约30cm、直径5～6cm的不锈钢棒在喷灯火焰上把一端弯成“了”型或倒等边三角形，并使柄与三角形的平面呈30°左右的角度，即制成不锈钢刮铲。不锈钢刮铲接触平板的一侧，要求平直光滑，使之既能进行均匀涂布，又不会刮伤平板的琼脂表面。

图6.22　玻璃刮铲

图6.23　不锈钢刮铲

（3）移液管的准备

无菌操作接种的移液管常为1mL或10mL刻度吸管。吸管在使用前应进行包裹灭菌。吸管的包裹如下（图6.24）：

图6.24　吸管包裹法

6.3.4　接种方法

1）斜面接种技术

进行斜面接种时，其操作规则如下：

（1）操作应在无菌室、超净工作台或接种箱内进行。

（2）接种前用记号笔在试管上标记，注明菌名、接种日期、接种人姓名等，在距离试管口2～3cm的位置（若不用记号笔标记也可贴标签）。

（3）点燃酒精灯，再用75%酒精棉球擦拭双手消毒。

（4）接种

用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面培养基上。必须按无菌操作法进行。具体操作如图6.25。

①左手持试管：将菌种和代接斜面的两支试管用大拇指和其他四指夹在左手中，斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。

图6.25　接种方法

②旋松管塞：先用右手松动棉塞，以便接种时容易拔出。

③取接种环：右手拿接种环（如同握笔一样），在火焰上将环端灼烧灭菌，然后将有可能深入试管的其余部分均匀灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。

④拔棉塞：用右手的小手指和手掌边夹住菌种管和待接试管的棉塞，在酒精灯火焰附近拔下，使试管口保持在火焰2～3cm处。

⑤接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环端接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。

⑥取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。

⑦接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面的底部向上部作波浪形来回划线，切勿划破培养基。

⑧塞棉塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时进入不清洁的空气。

⑨将接种环灼烧灭菌，放下接种环，将棉塞在火焰上燎过一两次，旋紧棉塞。

⑩将接完微生物的斜面试管放入恒温培养箱内培养24～48h（图6.26）。

图6.26　培养后的效果

（5）注意事项

接种操作应特别注意：

①接种前要用75%酒精清洁台面，最好在无菌室或超净工作台内进行。

②接种前要用75%酒精擦拭双手消毒。

③接种时拔下棉塞后一直用手指夹住，不要将其放在桌子或台子上，以免污染菌种。

④灼烧接种环要彻底，将接种丝烧红，柄端较粗部分反复灼烧。

⑤接种时试管口要一直保持在距火焰2～3cm处，不可过远，以免污染。

2）液体接种技术

用液体菌种接种液体培养基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培养基容器（试管或三角瓶等）中，将接种环在液体表面振荡或在容器壁上轻轻摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水，用接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液倒入液体培养基中。倒前需将试管口在火焰上灭菌。或用无菌的吸管或移液管吸取菌液接种，直接把液体培养物移入液体培养基中接种；也可利用高压无菌空气通过特制的移液装置把液体培养物注入液体培养基中接种；还可利用压力差将液体培养物接入液体培养基中接种（如发酵罐接入种子菌液）。

（1）压差接种

是利用两端压力差，使液体从高压流向低压的接种方法。例如孢子悬液接种和种醪接种。

图6.27　孢子悬液接种示意图

1，2.球心阀；3.蒸汽阀

①孢子悬液接种。如图6.27所示，孢子悬液接种一般是用接种瓶，瓶口连接短管和带旋转塞的球心阀2，管口装活接头下端。短管与接种瓶一同灭菌。罐顶的接种管口连接带旋塞的球心阀1和短管，管口装活接头的上端，短管中部又与蒸汽管连通。灭菌时先将灭过菌的接种瓶与罐顶接种短管上的活接头连接起来，打开阀1和阀2上的旋塞，开蒸汽阀3，通入蒸汽灭菌20min。灭菌完毕，关闭1和2上的旋塞，开动阀l，让罐中的无菌空气填充管内。待接种管冷却后，打开阀2，让罐中的无菌空气进入接种瓶，使瓶与罐中的压力平衡。关闭阀1和阀2，再将罐压稍稍降低，打开阀1和阀2，于是悬浮液借瓶和罐的压差而流入罐中。接种完毕，关闭阀1和阀2，打开旋塞，通蒸汽再度灭菌，拆卸活连接，包扎好接种管口。

②种醪接种。一般在种子罐排醪管口与发酵罐接种管口各装带旋塞的球心阀，两阀之间管道与蒸汽管连通，如图6.28（a）所示。接种前先对管1→2段进行灭菌，将阀1和阀2上的旋塞打开，开阀3，通入蒸汽，蒸汽充满全管从阀底旋塞排出。灭菌20min后，关闭阀3及阀l和阀2上的旋塞，打开阀1和阀2，于是种醪借压差而被压入发酵罐。接种完毕，关闭阀1和阀2，打开阀上的旋塞，通蒸汽再度灭菌，关闭旋塞。

如果种子罐容积很大，连接管道也粗，则可采用图6.28（b）的装置。接种前连接1→2间的短管，打开阀4、5、7、8、9、10，通蒸汽灭菌，蒸汽通过阀9和阀8排出。灭菌后，关闭阀7、8、9、10，打开阀4、5、6，培养液由发酵罐充满全管，提高种子罐液面，打开阀3，借助两罐压差进行接种。接种后关闭阀3、6，打开阀7、8、9、10，再度灭菌，灭菌完毕，拆卸短管1→2。

图6.28　种醪接种示意图

1，2.球心阀；3-10.蒸汽阀

（2）注射接种

一般用于种子罐接种，装置比较简单。在罐顶接种管口压盖一层橡胶膜，接种时用酒精在橡胶膜外表涂抹灭菌，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。

（3）摇瓶直接进罐法

本法适合种子罐接种，一般需三人配合操作。接种时消毒工要准备好棉花、酒精、火圈、石棉手套，将浸透酒精的火圈套在种子罐接种口周围，并用酒精棉擦洗接种口帽。当种子组操作人员准备好后，消毒工用火把点燃火圈，看罐人员关闭无菌空气进气阀，开大排气阀，待罐压降至0.01MPa时，关排气阀。消毒工手戴石棉手套，旋松接种口帽，将罐内余压放尽后，旋开接种口帽，并使其在火焰中保护。在最后开启接种帽的一刹那，火把应处在接种帽放气方向的反方向，以防止吹灭火把，在火圈被吹灭后，能够及时点燃。种子操作者按无菌操作规程开始接种操作，将摇瓶种子液倒入种子罐。如果有几瓶种子液，在操作间隙，消毒工应用接种口帽将接种口暂时遮盖。接种完毕，消毒工迅速将接种口帽旋紧，看罐人员迅速开无菌空气进气阀及罐排气阀，调节好空气流量及罐压。

3）固体接种技术

固体接种最普遍的形式是接种固体曲料。因所用菌种或种子菌来源不同，可分为：

（1）用菌液接种固体料

菌液包括用菌苔刮洗制成的悬液和直接培养的种子发酵液。接种时可按无菌操作法将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。注意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否则往往在用液体种子菌接种后曲料含水量加大，影响培养效果。

（2）用固体种子接种固体料

用固体种子接种固体料包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌，直接把接种材料混入灭菌的固体料。接种后必须充分搅拌，使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。固体料接种应注意“抢温接种”，即在曲料灭菌后不要使料温降得过低（尤其在气温低季节），一般在料温高于培养温度5～10℃时抓紧接种（如培养温度为30℃，料温降至35～40℃时即可接种）。抢温接种可使培养菌在接种后及时得到适宜的温度条件，从而能迅速生长繁殖，长势好，杂菌不易滋生。此法适用于芽孢菌和产生孢子的放线菌与霉菌的接种。另一个措施是“堆积起温”，即在大量的固体曲料接种后，不要立即分装曲盘或上帘，应先堆积起来，上加覆盖物，防止散热，使培养菌适应新的环境条件，逐渐生长旺盛，产生较大热量使堆温升高后，再分装到一定容器中培养。这样可以避免一开始培养菌繁殖慢，料温上不去，拖延培养时间，水分蒸发大，杂菌易发展等缺点。

4）穿刺接种技术

穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。具体操作如下：

①贴标签。

②点燃酒精灯。

③穿刺接种。方法如下：

a.手持试管。

b.旋松棉塞。

c.右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌。

d.用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却，再用接种针的针尖沾取少量菌种。

④接种的手持操作法。

接种有两种手持操作法：一种是水平法，如图6.29所示，它类似于斜面接种法。一种则称垂直法，如图6.30所示。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。

图6.29　水平穿刺接种

图6.30　垂直穿刺接种

⑤观察结果。

将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃恒温箱中培养。24h后观察结果（图6.31）（注意：若是具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散，反之则细而密）。

图6.31　穿刺接种菌种生长示意图