固氮菌的接种培养

6.4.1　固氮菌的培养

试验采用的方法是以酵素菌为种菌，运用阿须贝氏（Ashby）培养基（见表6. 1）选取固氮菌（Azotobacter）。

表6.1　阿须贝氏（Ashby）培养基
Table 6.1　The com position of Ashby culturemedium

考虑到工业生产中应该操作方便、经济实用，故在实际使用中，对培养基成分作了适当的调整。结果见表6.2。

表6.2　实际使用的固氮菌培养基
Table 6.2 The composition of Azotobacter culturemedium used in experiment

（1）培养基的配制：在1800 mL或2000 mL的烧杯中加入1000 mL的自来水，按配方称取各营养元素，然后将各营养成分按上面配方顺序逐一加入，待每一种成分溶解后加入下一成分。事实上实验证明，在本培养基中加入顺序并无影响，因为培养基各营养成分之间没有化学反应发生，不会造成沉淀物的形成。

（2）固氮菌的培养：称取15 g酵素菌菌种放入培养基中；将烧杯放入振荡箱中振荡培养，运行参数为温度30±1℃、110 r/m；持续培养3天。

（3）扩大培养：采用1∶10的比例重新配制培养基进行扩大培养。5天后检验测得培养基中固氮菌数为7.8106（个/mL）。图6.1为扩大培养前后固氮菌菌落图片。A部分为扩大培养初期的固氮菌菌落，B部分为扩大培养5天后的固氮菌菌落。

图6.1　固氮菌菌落
Fig. 6.1　Bacteria community of azotobacter

6.4.2固氮菌的接种培养

（1）粉煤灰为载体的接种培养试验

扩大培养的菌种取出后分装于小烧杯，将适量粉煤灰混入菌液中，搅拌均匀，粉煤灰的投加对固氮菌的生长影响不大，固氮菌的活菌数量几乎不变。这说明固氮菌对粉煤灰较强的适应能力。接种培养15天后，测得固氮菌活菌数为2.8×106（个/克）。将此粉煤灰分为两部分：一部分用于继续培养，至60天时测得固氮菌活菌数为1.8×108（个/克），证明粉煤灰是固氮菌良好的载体；另一部分用于以下试验。

（2）粉煤灰混合吸附了造纸废水有机质的粉煤灰为载体的接种培养试验

在试验（1）分出的含固氮菌的粉煤灰中投加吸附了造纸废水有机质的粉煤灰，刚开始时，固氮菌的活菌数量骤然下降，约下降两个数量级，但是，固氮菌很快就开始恢复，经过60天的培养，已经确认恢复到正常水平，活菌数达到4.2×107（个/克）。这时，菌落的颜色由白色半透明变成局部灰暗，说明这时的固氮菌已经发生了变化。而固氮菌对吸附了造纸废水中的有机质的粉煤灰同样有很强的适应能力。继续培养，至100天时，测得固氮菌的活菌数为7.8×107（个/克）。这证明吸附了造纸废水中的有机质的粉煤灰同样可以作为固氮菌的载体。

（3）吸附了造纸废水有机质的粉煤灰单独作为载体的接种培养试验

单独以吸附了造纸废水有机质的粉煤灰为固氮菌的载体是关键阶段。在这一阶段，粉煤灰对固氮菌的生长影响很大。开始时，固氮菌的活菌数量骤然下降到无法检出，经过45天培养，固氮菌菌落开始变大，固氮菌活菌数增加到1.2×106（个/克）。到60天时，固氮菌菌落变得较大较壮；到100天时，固氮菌活菌数达到6.9×107（个/克），基本可以确认恢复正常。这时的菌落已变得灰里半透明，非常明显，说明固氮菌已经发生了很大的变化。固氮菌培养成功。

上述试验样品培养后于室内自然风干或者在低温下烘干。经农业部农产品质量监督检验测试中心（沈阳）检测，载有固氮菌的粉煤灰自然风干（或烘干）后含菌量统计于表6.3。

表6.3粉煤灰中固氮菌的活菌数量
Table 6.3AmountsofAzotobacterinflyash

固氮菌的接种培养试验证明：固氮菌可以被培养在粉煤灰中、吸附了造纸废水有机质的粉煤灰中，即粉煤灰与处理造纸废水的粉煤灰废渣均可以作为固氮菌的载体。固氮菌在粉煤灰中培养之后，其菌落形状不变，颜色变深。