实训19 菌种保藏
一、实训目的
（1）掌握菌种保藏的基本原理。
（2）熟悉菌种保藏的常用方法。
二、实训原理
菌种是一种重要的微生物资源，菌种保藏是一切微生物工作的基础。保藏的目的就是利用一切条件使菌种不死亡、不变异、不污染，有利于生产、科研的正常进行。自19世纪末人们开始尝试微生物菌种保藏以来，已建立了许多长期保藏微生物菌种的方法。
微生物菌种保藏的基本原理是使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。干燥、低温和隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。有针对性地创造干燥、低温和隔绝空气的外界条件，是微生物菌种保藏的基本技术。所以尽管菌种保藏方法很多，但基本上都是根据这三个条件进行设计的。几种常用方法介绍如下。
1．斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌种充分生长好后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2～8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微生物的种类而不同。霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月移种一次，酵母菌2个月移种一次，细菌最好每月移种一次。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏方法，优点是操作简单，使用方便，不需要特殊的设备，缺点是菌种容易变异。若菌种经常使用且条件不变，可应用此法。
2．半固体穿刺保藏法
用穿刺接种法将待保藏的菌种直刺入半固体培养基直立柱中央，注意不要穿透底部，然后沿原线拉出。待菌种充分生长好后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2～8℃的冰箱中保藏。
这种方法一般可保藏菌种半年至一年。
3．液体石蜡保藏法
（1）先将液体石蜡进行灭菌，然后放在室温或40℃恒温培养箱中，使水汽蒸发掉，即可备用。
（2）将需要保藏的菌种在最适合的斜面培养基上培养，得到健壮的菌体或孢子。
（3）用灭菌吸管吸取已灭菌的石蜡，注入已生长好的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。
（4）将试管直立，置2～8℃冰箱中保藏。
液体石蜡一方面可以防止固体培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面也可以阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，从而延长了菌种保藏的时间。此法实用且效果好，霉菌、放线菌和芽孢菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保存1年左右。此法的优点是制作简单，不需要特殊设备，不需要经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占空间较大，同时也不方便携带。
4．甘油管保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油溶液中，置于低温下保藏。本法较简便，但需要配备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃，保藏期约为0．5～1年，若采用－70℃则保藏期可达10年。
将待保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃高压蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度为20%，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。
5．沙土管保藏法
（1）取河沙过筛（40目），去掉大沙粒，用10%盐酸浸泡，除去其中的有机杂质，盐酸用量应浸没沙面，约浸2～4h，然后用清水洗至中性，烘干，用吸铁石吸出沙中的铁屑，备用。
（2）取非耕作土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，烘干，碾碎，用100目筛过筛，以去除粗颗粒。
（3）将沙与土以6∶4（质量比）混合均匀，装入干净小试管中，每支1g左右，加棉塞包扎管口，高压蒸汽灭菌三次并作无菌检查。
（4）接种分为干法接种和湿法接种。干法接种是将斜面上生长好的培养物，用接菌环刮取孢子，接种于无菌的沙土管中，搅拌均匀，注意勿接入培养基；湿法接种是将已准备好的菌种斜面培养物，加入3～5mL无菌蒸馏水，制成均匀的菌悬液，再用无菌吸管吸取菌悬液加入到沙土管中，每管约10滴，以管内的沙全部湿润为宜。
（5）将接种后的沙土管放在装有无水氯化钙等干燥剂的干燥器中，吸水干燥，或放在真空干燥器中接通真空，抽真空干燥。抽干时间越短越好，务必在12h内抽干。
（6）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上进行培养，观察有无杂菌生长以及所保藏菌种的生长情况。如果出现杂菌或所保藏菌种菌落数很少或根本不生长，则说明制作的沙土管有问题，需进一步抽样检查。
（7）经检查没有问题，则存放于4℃冰箱中保存。每半年检查一次活力和染菌情况。
此法多用于能产孢子的霉菌、放线菌，在抗生素生产中应用最广，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。
6．液氮保藏法
（1）安瓿管的准备：用于液氮保藏的安瓿管要求即能经121℃高压蒸汽灭菌，又能在－196℃低温下长期保存。现在已普遍使用聚丙烯塑料制成带有螺旋帽和垫圈的安瓿管，用自来水洗净后，经蒸馏水多次冲洗，烘干，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）保护剂的准备：配制10%甘油溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min。使用前随机抽样进行无菌检查。
（3）接入菌种：将菌种用10%的甘油溶液制成菌悬液，分装入安瓿管中，每管0．5 mL，拧紧螺旋帽。
图3－27 液氮罐
（4）预冻：将安瓿管以每分钟下降1℃的速度慢速冻结至－70℃。避免细胞急剧冷冻，在细胞内形成冰晶，降低存活率。
（5）保藏：将安瓿管快速转入液氮罐（图3－27）液相中，并记录菌种在液氮罐中存放的位置和安瓿管数。
（6）恢复培养：需要用保藏的菌种时将安瓿管取出，立即放入38～40℃水浴中急速解冻，直到全部溶化为止。再采用无菌操作技术，打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
7．冷冻干燥保藏法
此法是先使微生物在极低温度（－70℃）下快速冷冻，然后在减压下利用升华原理除去水分。利用有利于菌种保藏的一切因素，使微生物始终处于低温、干燥和缺氧的条件下，因而是迄今最有效的菌种保藏方法之一。
用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至数十年，其菌种要特别注意纯度，不能污染杂菌，这样再次使用该菌种时才不会出现差错。细菌和酵母菌菌种要求培养到稳定期，一般细菌培养24～48h，酵母菌培养3天，若用对数生长期菌种进行保藏，其存活率反而会降低。放线菌和霉菌一般需培养7～10天，保存孢子比其营养体效果更好。
在冷冻过程中，为了避免恶劣条件对微生物的损害，常采用添加保护剂的方法。使用保护剂来制备细胞悬液，可以防止冷冻或水分不断升华对细胞造成的损伤。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、糖类、甘油和二甲基亚砜等。
本实训以冷冻干燥保藏法为例，介绍具体操作方法。
三、实训器材
1．菌种
待保藏的各种菌种。
2．试剂
2%盐酸、牛奶。
3．设备
低速离心机、真空冷冻装置和高频电火花器等。
4．其他
安瓿管、滴管、脱脂棉、干冰和标签等。
四、实训步骤
1．安瓿管的准备
安瓿管应采用中性硬质玻璃较为适合。安瓿管先用2%盐酸浸泡8～10h，再用自来水冲洗多次，最后用蒸馏水冲洗1～2次，烘干。将印有菌名和接种日期的标签放入安瓿管内，有字的一面应向管壁。管口塞上棉花，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2．脱脂牛奶的制备
先将牛奶煮沸，除去上面的一层脂肪，然后用脱脂棉过滤，3000r／min离心15min。如果一次不行再离心一次，直至除尽脂肪为止。牛奶脱脂以后，115．6℃高压蒸汽灭菌30min，并做无菌检查。
3．菌悬液的制备
将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅动，使其均匀地悬浮在牛奶内（切勿将琼脂刮到牛奶中）。
4．分装
用无菌长滴管将菌悬液分装到安瓿管底部，每支安瓿管的装量约为0．2mL。
5．预冻
将分装好的安瓿管在－40～－25℃的干冰酒精中进行预冻，1h后即可抽气进行真空干燥。
6．真空干燥
预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。
7．封管
封管前将安瓿管装入歧形管，真空度抽至0．01mmHg（1mmHg＝133．32Pa）后，再用火焰熔封，封好后要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频火花器应射向安瓿管的上半部。
8．保藏
做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。
9．恢复培养
如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，然后将安瓿管近口端在火焰上烧热，滴几滴无菌水使安瓿管破裂，再用接种针挑取松散的干燥样品，在斜面上接种。也可以先将无菌液体培养基加入安瓿管中，使样品溶解，然后用无菌吸管取出菌液至合适的培养基中进行培养。
五、思考题
（1）经常使用的细菌，用哪一种方法保藏即好又简便？试举例说明。
（2）细菌用什么方法既能长时间保藏而又不变异？
（3）沙土管保藏法适合保藏哪一类微生物？
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