任务4.1理论基础

任务4.1　理论基础

自然状态下的物品、土壤、空气及水中都含有各种微生物。在食品微生物研究及利用过程中，不能有杂菌污染，需要对所用的物品、培养基包括环境等进行严格处理，以消除有害微生物的干扰。

控制有害微生物，需了解下列一些基本概念。

1）灭菌

采用强烈的理化因素，使任何物体内外部的一切微生物（包括芽孢和真菌的孢子）永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，如各种高温灭菌措施等。经过灭菌的物品称为“无菌物品”。灭菌可分为杀菌和溶菌。杀菌是指菌体失活，但菌形尚存。溶菌是指菌体死亡后发生溶解、消失。

2）商业无菌

商业无菌指食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物。

3）消毒

消毒就是采用较温和的理化因素，杀死物体表面或内部的病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。例如对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行的巴氏消毒法等。

4）防腐

防腐就是利用某种理化因素抑制微生物的生长繁殖，使微生物暂时处于不生长、不繁殖、但又未死亡的状态，属于一种抑菌作用，是防止食品腐败的有效措施。防腐的措施很多，主要有低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度及添加防腐剂等。

5）除菌

除菌是一种用机械的方法，如过滤、离心分离、静电吸附等，除去液体或气体中微生物的方法。

6）无菌

无菌就是指环境及物品中无活微生物检测出。

7）抑菌

抑菌就是利用某些物质或因素来抑制微生物的生长繁殖。

8）杀菌

杀菌就是某些物质或因素具有杀灭微生物的作用。

9）化疗

利用对病原菌具有高度选择毒力，而对机体本身无毒害作用的化学物质，杀死或抑制病原微生物的方法称为化学治疗，简称化疗。各种抗生素、磺胺类药物等都是常用的化学治疗剂。

消毒灭菌主要利用物理或化学因素。各种理化因子究竟能起到灭菌、消毒、防腐中的哪种效果，主要取决于理化因子本身的强度或浓度、作用时间、微生物对其敏感性及菌龄等综合因素。在实际中，我们无论采用哪一种控制有害微生物的方法，都应做到既要杀死有害微生物，又不破坏物体的基本性质。目前，食品工业中采用的消毒与灭菌技术主要包括各种冷杀菌技术、高温杀菌及化学杀菌技术等。

4.1.1　低温杀菌技术

近年来，为了更大限度保持食品本身的固有品质，一些新型的灭菌技术——冷杀菌技术（如超高压杀菌、超高压脉冲电场杀菌、脉冲强光杀菌、放射线杀菌等）受到了国内外食品行业的极大关注，成为21世纪食品工业研究和推广的重要高新技术之一。

冷杀菌技术即低温杀菌技术，是在食品温度不升高或升高很低的条件下进行杀菌。与传统的热杀菌比较，冷杀菌可弥补热杀菌的不足，能最大限度地保持食品功能成分的生理活性及原有的色香味及营养成分，是一种安全高效的新型杀菌技术。

1）超高压杀菌技术

超高压杀菌是将食品物料以某种方式包装以后，放入液体介质（通常是食用油甘油与水的乳液）中，在100～1000MPa压力下作用一段时间后，使之达到灭菌要求。其基本原理是利用压力对微生物的致死作用，主要是通过破坏其细胞壁、使蛋白质凝固、抑制酶的活性和DNA等遗传物质的复制等来实现。

采用超高压技术，在400～600MPa的压力下，能杀死食品中几乎所有的细菌、霉菌和酵母菌。这种经超高压处理过的食品避免了一般高温杀菌带来的不良变化，口感好，色泽天然，安全性高，保质期长。但该技术不能连续生产，只能分批运用。超高压杀菌可能引起果蔬在极限压力下变形或状态明显改变，因此主要用于没有固定形状的果蔬制品。

2）超高压脉冲电场杀菌技术

超高压脉冲电场杀菌是采用高压脉冲器产生的脉冲电场进行杀菌的方法。其基本过程是用瞬时高压处理放置在两极间的低温冷却食品。其机理基于细胞膜穿孔效应、电磁机制模型、电解产物效应、臭氧效应等假设。其作用主要有脉冲电场和磁场的交替作用和电离作用两种。

（1）脉冲电场和磁场的交替作用

脉冲电场产生磁场，细胞膜在脉冲电场和磁场的交替作用下，通透性增加，振荡加剧，膜强度减弱从而使膜破坏，膜内物质容易流出，膜外物质容易渗入，细胞膜的保护作用减弱甚至消失。

（2）电离作用

电极附近物质电离产生的阴阳离子与膜内生命物质作用，阻碍了膜内正常生化反应和新陈代谢等过程进行的同时，液体介质电离产生臭氧的强烈氧化作用，使细胞内物质发生一系列的反应。通过电场和电离的联合作用，杀灭菌体。

超高压脉冲电场杀菌可保持食品的新鲜及其风味，营养损失少。但因其杀菌系统造价高，制约了它在食品工业上的应用，且超高压脉冲电场杀菌在黏性及固体颗粒食品中的应用还有待进一步研究，因此在食品工业中应用较少。

3）脉冲强光杀菌技术

脉冲强光杀菌是采用脉冲的强烈白光闪照方法进行灭菌。它通过惰性气体发出与太阳光谱相反、但强度更强的紫外线至红外线区进行杀菌。使用高强度白光的极短脉冲，杀死食品表面的微生物。该高强度的白光类似阳光，但仅以几分之一秒的速度反射出来，比阳光更强，能迅速杀死细菌。脉冲强光下使微生物致死作用明显，可进行彻底杀菌。在采用脉冲强光杀菌操作时对不同的食品、不同的菌种，需控制不同的光照强度与时间。脉冲强光杀菌技术在食品工业中可用于延长以透明物料包装的食品的保鲜期。

4）臭氧杀菌技术

臭氧的氧化力极强，仅次于氟，能迅速分解有害物质，杀菌能力是氯的600～3000倍，分解后迅速还原成氧气。

臭氧杀菌作用机制可归纳为以下几种。

①作用于细胞膜，导致细胞膜的通透性增加、细胞内物质外流，使细胞失去活力。

②使细胞活动必需的酶失活。这些酶既有基础代谢的酶，也有合成细胞重要成分的酶。

③破坏细胞质内的遗传物质或使其失去功能。臭氧杀灭病毒是通过直接破坏RNA或DNA完成的；而杀灭细菌、霉菌类微生物则是先作用于细胞膜，使其构成受到损伤，导致新陈代谢障碍并抑制其生长，臭氧继续渗透破坏膜内组织，直至其死亡。

臭氧水是一种广谱杀菌剂，它能在极短时间内有效地杀灭大肠杆菌、蜡杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、流脑双球菌等一般病菌以及流感病毒、肝炎病毒等多种微生物。可杀死和氧化鱼、肉、瓜果蔬菜等食品表面能产生异常变化的各种微生物和果蔬脱离母体后继续进行生命活动的微生物，加速成熟乙烯气体，延长保鲜期。

5）紫外线杀菌技术

紫外线是一种短光波，波长范围是136～397nm，具有较强的杀菌和诱变作用，其中波长为265～266nm的紫外线杀菌力最强。紫外线主要作用于细胞的DNA，能使相邻的胸腺嘧啶（T）形成二聚体，使DNA链发生断裂或交联，因而导致微生物死亡。同时紫外线还可使O₂发生电离，最终形成具有杀菌作用的臭氧。

微生物对于不同波长的紫外线的敏感性不同，紫外线对不同微生物照射致死量也不同。革兰氏阴性无芽孢杆菌对紫外线最敏感，而杀死革兰氏阳性球菌的紫外线照射量需增大5～10倍。

紫外线穿透力弱，所以比较适用于对空气、水、薄层流体制品及包装容器表面的杀菌。近年，随着强力紫外灯开发，对水杀菌装置也高效化，用253.7nm紫外线对水照射6min大肠杆菌去除率为100%，照射12min，芽孢杆菌一类高抗性细菌杀灭率达100%。

6）放射线杀菌技术

放射线同位素放出的射线通常有α、β、γ等三种射线，用于食品内部杀菌只有γ射线。γ射线是一种波长极短的电磁波，对物体有较强的穿透力，微生物的细胞质在一定强度γ射线下，没有一种结构不受影响，因而使菌体细胞产生变异或死亡。微生物细胞内的核酸代谢环节能被放射线抑制，蛋白质因射线照射作用而发生变性，其繁殖机能受到最大损害。射线照射不会引起温度上升，一般对热抵抗力强的微生物，对放射线的抵抗力也较大。

7）微波杀菌技术

微波是指频率为300MHz～300GMHz的电磁波。微波杀菌是让微波与物料直接相互作用，将超高频电磁波转化为热能的过程。微波杀菌是微波热效应和生物效应共同作用的结果。微波通过对细胞膜表面的电位分布影响而引起细胞周围电子和离子浓度的变化，从而改变细胞膜的通透性能，使得微生物细胞因此营养不良，不能正常新陈代谢，生长发育受阻碍死亡。微波导致氢键松弛、断裂和重组，从而诱发遗传基因或染色体畸变，甚至断裂。微波杀菌正是利用电磁场效应和生物效应起到对微生物的杀灭作用。采用微波装置在杀菌温度、杀菌时间、产品品质保持、产品保质期及节能方面都有明显的优势。德国内斯公司研制的微波室系统，加热温度为72～85℃，时间为1～8min，杀菌效果十分理想，特别适用于已包装的面包、果酱、香肠、锅饼、点心以及贮藏中杀灭虫、卵等。微波处理的食品保质期达6个月以上。

目前，我国食品工业中大多采用热杀菌技术，致使产品质量、档次不高，因此要加速我国食品生产技术更新，提高产品档次及国际市场竞争力，就必需采用更为适当的食品杀菌技术。而冷杀菌技术在未来食品工业中将起到重要作用，并将带动整个食品行业的发展。

4.1.2　高温杀菌技术

由于微生物对高温较敏感，所以可采用高温进行杀菌，又称热力灭菌。

高温杀菌的基本原理是高温导致微生物的蛋白质、核酸等重要生物高分子发生变性和破坏。根据热能的来源不同，高温杀菌可分为干热灭菌和湿热杀菌两种方法。

1）干热灭菌

干热灭菌是一种利用火焰或热空气杀死微生物的方法，一般适用于不怕火烧或烘烤的金属制品和玻璃器皿。干热灭菌具有简便易行的优点，但使用范围有限。

（1）灼烧法

灼烧法是将灭菌物品在酒精灯火焰上灼烧至红热，使所带微生物碳化成灰。这是一种最简便快捷的干热灭菌法。但仅适用于体积较小的玻璃或金属器皿，如各种金属制的小工具、试管口、玻璃棒等。

（2）烘烤法

在烘箱中利用热空气进行灭菌的方法称为烘烤法。由于空气的传热性能及穿透力不及饱和蒸汽，加之菌体在干热脱水条件下不易被热能杀死，所以烘烤灭菌需要较高的温度和较长的时间。烘烤法适用于体积较大的玻璃、金属器皿及其他耐干燥物品的灭菌，如培养皿、三角瓶、吸管、烧杯及比较大的金属工具。

在进行烘烤灭菌时，将包装好的待灭菌物品均匀放入烘箱内，打开箱顶通气孔，以排除烘箱内湿空气。接通电源，待箱温达到100～105℃时关闭通气孔，让箱温继续升至160～170℃，控制温度调节器，维持恒温2h后关闭电源，待箱温自然降至60℃以下时，方可取出被灭菌的物品。进行烘烤灭菌时，升温或降温不能过急；烘箱内温度不能超过180℃，以免将包装纸和棉花烤焦而引起燃烧；灭菌后的物品应随用随打开包装纸。

表4.1　菌体蛋白凝固温度与其含水量的关系

（引自薛泉宏，微生物学，2000）

表4.2　干热灭菌与温热灭菌穿透力的比较

（引自薛泉宏，微生物学，2000）

2）湿热杀菌

湿热杀菌是一种用煮沸或饱和热蒸汽杀死微生物的方法。湿热杀菌与干热灭菌相比，具有灭菌温度较低和灭菌时间较短的优点。因为热蒸汽的穿透力强，同时在湿热条件下菌体蛋白质的含水量增加，蛋白质的凝固点会随含水量的增加而降低。此外，湿热杀菌的范围也比干热灭菌广。所以，湿热杀菌法比干热灭菌更有效。多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。

（1）高压蒸汽灭菌

在高压锅内，利用高于100℃的水蒸汽温度杀死微生物的方法称为高压蒸汽灭菌。其原理是水的沸点随水蒸汽压力的增加而升高，而加大压力是为了提高水的沸点。这是一种应用最广，效率最高的灭菌方法。

高压蒸汽灭菌采用的灭菌压力和时间应因被灭菌物品而异。通常灭菌的压力为104 kPa，温度约为121℃，灭菌时间为20～30min；若高温易破坏的物质，可在115℃下维持35 min；若是一些耐高温容积大的物品，一般温度为128℃，灭菌时间延长至1～2h。灭菌时间应从达到要求温度或压力时开始计。

在整个高压灭菌过程中，升压前排尽锅内冷空气是灭菌成功的关键。因为空气是热的不良导体，当高压锅内的压力升高后，冷空气聚集在高压锅中下部，使饱和热蒸汽难与被灭菌的物品接触，冷空气受热膨胀也产生一种压力，这样，虽然压力表的压力值达到要求，但实际上被灭菌的物品的温度却未能达到指标，就会导致灭菌效果不彻底或灭菌失败。

高压锅在使用时，升压降压都不能太急；只有压力降至0时才能打开锅盖；灭菌后的物品不可久放在锅内，以免被冷凝水打湿；灭菌锅内物品不能放置过紧，否则将会影响灭菌效果。

表4.3　高压蒸汽灭菌器中温度与压力的关系

（引自吴金鹏，食品微生物学，2002）

（2）间歇灭菌

间歇灭菌也叫分段灭菌法。其方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮30～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同样的方法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3次，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。该法手续麻烦，时间长，一般只适用于不耐热培养基的灭菌，如含糖培养基和含硫培养基等。

（3）煮沸消毒法

将待灭菌的物品放在沸水中保持15～30min，可以杀死微生物的营养体。若要杀死细菌的芽孢，则需2～3h。此方法适用于可以浸泡在水中的物品，如一般食品、器材和衣物等。

（4）巴氏消毒法

用于牛奶、果酒、啤酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的消毒，其主要目是杀死其中无芽孢的病源菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60～85℃下处理15s至30min。具体的方法可分为以下几种：

①低温维持法（LTH），如在60℃下保持30min可进行牛奶消毒。

②高温瞬时法（HTST），用于牛奶消毒时只要在85℃下保持15s即可。

③超高温杀菌技术（UHT）是利用热交换器或直接蒸汽加热，使食品在135～150℃温度下，保持几秒或几十秒加热杀菌后，迅速冷却的杀菌方法。该方法杀菌效率高，物料产生的物理、化学变化小，因此，对食品的外观、风味、营养素等几乎没有影响，可以收到很好的灭菌效果。

在实际生产应用中，UHT杀菌法常常和无菌包装技术联系在一起，使食品保持无菌状态，可以无需冷藏而在常温下长期保存。

3）影响热力灭菌的因素

（1）微生物

不同种类微生物对热的抵抗力不同，即使同种类微生物在不同的生长发育阶段对热的抵抗力也不同。

（2）温度与作用时间

无论哪种热力灭菌方法，灭菌温度与作用时间成反比。测定灭菌效果，常用致死温度和致死时间来表示。致死温度指能在10min内杀灭微生物的温度；致死时间指在一定温度条件下杀灭微生物所需的最短时间。

（3）灭菌物品的含菌量

灭菌物品的含菌量（包括营养细胞、芽孢、孢子）越多，杀死最后一个微生物细胞所需的时间就越长，即灭菌时间越长。实践中，由天然原料尤其是麸皮等某物原料配制成的培养基，一般含菌量高，而合成培养基的含菌量较低。含菌量与灭菌时间的关系见表4.4。

表4.4　芽孢数目和灭菌时间的关系

（引自薛泉宏，微生物学，2000）

（4）灭菌对象的pH值

灭菌对象的pH值对灭菌效果有较大的影响（表4.5），pH值为6.0～8.0时微生物不易死亡；pH值小于6.0时，微生物最易死亡。

表4.5　pH值对灭菌时间的影响

（引自薛泉宏，微生物学，2000）

（5）灭菌对象的体积

灭菌对象体积的大小会影响热的传导速率。盛放培养基的玻璃器械（皿）体积的大小对灭菌效果的影响特别明显（表4.6）。

表4.6　不同容量的液体在高压灭菌器内的灭菌时间

（引自薛泉宏，微生物学，2000）

4.1.3　其他理化因素抑杀菌技术

1）过滤除菌

过滤除菌是利用细菌过滤器来滤除空气或不能加热的液体（如血清、酶等）中的微生物。细菌过滤器上的孔径极小，能使液体或空气从孔径通过，而将细菌和其他悬浮物截留。为提高过滤速度，常用加压法或减压法加速进行。过滤器在使用前，一般需经高压蒸汽灭菌，并以无菌操作法将其安装使用。

2）超声波灭菌

超声波的振动频率在20000Hz以上，具有强烈的生物学作用，它可使微生物的菌体细胞破裂。几乎所有的微生物都无法抵抗超声波的破坏，只是各种微生物对超声波的敏感程度不同。球菌较杆菌的抗性强，细菌的芽孢对超声波的抵抗力比繁殖体大。超声波的杀菌效果与其频率、处理时间及细胞大小、形状、数量均有关。一般认为超声波能使微生物细胞内容物受到强烈的震荡而破坏；一般水溶液内经超声波的作用能产生过氧化氢，有杀菌能力；超声波的热效应使细胞的酶受到破坏。也有人认为细胞被裂解是因为液体受高频声波作用时，溶解的气体变为小气泡，小气泡的冲击使细胞破碎。所以，超声波也被用来保藏食品。有人试验800 kHz的超声波可以杀死酵母菌；在0.01%甲醛溶液中的炭疽杆菌经超声波处理5min后全部死亡；用超声波进行牛乳消毒经15～60s消毒后牛乳，可以保存5天而不发生酸败。一般消毒乳液若再经超声波处理，在冷藏条件下保存18个月还未发现变质。

因超声波能有裂解细胞的能力，所以可借此来提取细胞的组成物质，如提取细胞内的酶，以供生化研究；提取免疫物质以供血清学研究；提取DNA以供微生物遗传和分类的研究。

3）化学消毒灭菌法

化学消毒灭菌法是利用化学药剂对微生物进行杀灭或抑制。抑制或杀死微生物的化学药物很多，其中有的可以抑制微生物的代谢活动，起抑菌作用；有的可破坏微生物的代谢机制或菌体结构，起杀菌作用。抑菌与杀菌是相对的，通常高浓度时杀菌，较低浓度时抑菌。此外，化学物质的抑菌和杀菌作用还与微生物的敏感性、接触时间长短、温度及所处的环境等有关。

（1）化学表面消毒剂

①酸类。无机酸如HCl、HNO₃、H₂SO₄等都有杀菌作用，主要是高浓度的氢离子能引起微生物菌体中蛋白质和核酸水解，并使酶失去活性。有机酸如甲酸、乳酸、醋酸的杀菌与其整个分子的作用机制有关。

一些有机酸能抑制微生物（尤其是霉菌）酶和代谢的活性，常加在食品、饮料或化妆品中以防止霉菌等微生物的生长。山梨酸及其钾盐常用于酸性食品（如乳酪）的保存；苯甲酸及其钠盐常用于其他酸性食品和饮料中。

②碱类。碱能在水中电离为OH－和金属离子。氢氧根离子的浓度与碱类的杀菌作用有关，其离子浓度越高，杀菌力越强。强碱能水解蛋白质和核酸，破坏微生物的酶系统和结构，引起微生物菌体死亡。一般G－菌对碱较G＋菌敏感，芽孢菌对碱的抵抗力强，病毒对碱也敏感。常用的碱类消毒剂有石灰、NaOH、NaHCO₃等溶液。

③重金属盐类。重金属离子对微生物有毒害作用，特别是Ag^＋、Hg^2＋、Cu^2＋等离子，能与蛋白质的-SH基结合，使蛋白质发生变性或沉淀，而导致微生物的死亡，因此，可用这些重金属盐类的溶液进行杀菌与消毒。

④氧化剂。K₂MnO₄、H₂O₂、卤素等是常用的氧化剂，它们能释放出游离氧或使其他化合物放出氧，氧化蛋白质的氨基、羟基或其他基团，使其代谢机能发生障碍，导致微生物死亡。如0.1%K₂MnO₄溶液用于皮肤、水果、饮具等的消毒，一般在酸性环境中30min内可杀死炭疽芽孢杆菌的芽孢。

⑤有机物质类。醇类、醛类、酚类等有机物能损伤质膜和细胞壁，抑制酶的活性，使蛋白质变性而导致微生物死亡。

酒精是常用的醇类消毒剂，其好的杀菌浓度为75%左右。而高浓度酒精的杀菌作用会减弱，主要原因是高浓度的酒精会在菌体外面形成一层干燥膜，阻碍酒精分子进入细胞内，而影响杀菌效果。

新洁尔灭是一种常用、高效、低毒的消毒剂，它可降低菌体表面张力，使菌体细胞代谢紊乱而死亡。常用0.25%新洁尔灭溶液进行皮肤、小型器皿及空气的消毒。

石炭酸及其衍生物也具有较强的杀菌力，微生物的营养细胞在1%石炭酸溶液中处理5～10min便死亡，芽孢则需处理几小时或更长时间才能死亡。来苏尔的杀菌力比石炭酸大四倍。酚类的杀菌机制也是使蛋白质变性。

（2）化学治疗剂

化学治疗剂是一类能选择性地抑制或杀死机体内的病原微生物并可用于临床治疗的特殊化学药剂。化学治疗剂对宿主和病原微生物的作用具有选择性，它们能阻碍病原微生物代谢的某个环节，使其生命活动受到抑制或死亡，而对宿主细胞毒副作用很小，所以可以内用。化学治疗剂主要有抗代谢物和抗生素。

①抗代谢物。有些化合物的结构与生物体所必需的生长因子结构很类似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的作用，干扰微生物的正常代谢，达到抑制微生物生长的目的。这些生长因子结构类似物称为抗代谢物，若用于疾病治疗，可称为抗代谢药物。

抗代谢物的种类较多，其中最典型的是磺胺类药物，其核心结构与细菌的生长因子对氨基苯甲酸相似。对氨基苯甲酸主要用于四氢叶酸的合成，四氢叶酸是生物体内一种重要的一碳单位转移的载体，是生物体内合成代谢中不可缺少的重要辅酶。以对氨基苯甲酸为生长因子的细菌，会因为磺胺类药物的存在而不能存活。但人体不能利用对氨基苯甲酸合成四氢叶酸，需体外直接提供四氢叶酸，故磺胺类药物对人体的代谢没有影响。

②抗生素。抗生素是微生物或某些高等动植物在生命活动过程中产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物及其衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响他种生物的生命活动。

抗生素通过抑制细胞壁的合成、改变细胞膜的通透性、抑制蛋白质及核酸复制等反应机理抑制或杀死微生物，是目前治疗微生物感染和肿瘤等疾病的常用药物。

表4.7　常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度

（引自程丽娟，微生物学实验技术，2000）