基于的标记

PCR技术问世不久，便以其简便、快速和高效等特点迅速成为分子生物学研究的有力工具，尤其是在DNA标记技术的发展上更是起到了巨大作用。根据所用引物的特点，这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记包括RAPD标记、ISSR标记、SRAP标记等。随机引物PCR所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究。特异引物PCR标记包括SSR标记、STS标记等。特异引物PCR所扩增的DNA区段是事先已知的明确的，具有特异性。因此特异引物PCR标记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解。

RAPD标记。随机扩增的DNA多态性（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）技术是以基因组为模板，以一个随机的寡核苷酸序列（通常10个碱基对）作引物，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA产物，来检测DNA的多态性。该方法简单易行，受到研究者的普遍青睐，但RAPD技术最大的缺点是重复性和稳定性差，为解决这个问题，Parna和Michelmore将RAPD标记转化为特异序列扩增的SCAR（sequence characterizal amplified region）标记。

SCAR标记。SCAR标记是1993年在RAPD等随机标记技术的基础上发展起来的。为了提高所找到的某一随机标记在应用上的稳定性，可将随机引物扩增的片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物（18～24 bp）。其操作流程基本为：先做RAPD等随机引物分析，然后把目标的RAPD等随机片段回收、克隆和测序，再根据该序列设计特定引物，此引物通常包含有原来的RAPD引物序列，多为20～24 bp，再用该引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，这样就可以把与原来的RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。由于SCAR标记使用的引物长，因而实验的可重复性高，因此比RAPD和其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好。

ISSR标记。简单序列重复区间（inter-simple sequence repeats，ISSR）DNA标记技术是由Zietkiewicz等（1994）提出的，该技术检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。ISSR稳定性比RAPD好，呈孟德尔式遗传，具显性或共显性特点。近年来，ISSR标记技术已应用于植物遗传分析的各个方面，如品种鉴定、遗传关系及遗传多样性分析、基因定位、植物基因组作图研究等。

SSR标记。微卫星（microsatellite）又称为简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）或是短串联重复（short tandem repeat，STR），这是一类由几个核苷酸（一般2～4个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。这些串联重复序列由于重复次数的不同而造成序列长度的多态性。生物学家在20世纪70年代就知道真核生物基因组中存在着短串联重复位点，但直至1982年Hamada等发现从酵母到脊椎动物的基因组中都存在多拷贝的简单序列重复，Tautz等于1984年用不同微卫星序列与不同有机体中的基因组DNA杂交，证实这些序列的数目具有广泛性并且大量存在。因而被广泛认为是取代RFLP之后的第二代分子标记。

STS标记。STS（sequence-tagged site）标记是根据单拷贝的DNA片段两端的序列，设计一对特异引物，扩增基因组DNA而产生的一段长度为几百个碱基对的特异序列。RFLP标记经两端测序，可转化为STS标记。1989年，Olson等注意到STS在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。用STS进行物理作图，可通过PCR或杂交途径来完成。STS标记可作为比较遗传图谱和物理图谱的共同位标，这在基因组作图上具有非常重要的作用。

AFLP标记。扩增片段长度多态性（amplified fragments length polymorphism，简称AFLP），该技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的特点，多态性强、试验结果稳定性、重复性好、典型的孟德尔方式遗传，但它所显示的只是扩增片段的有与无，是显性标记。由于AFLP引物设计的巧妙与搭配的灵活使其成为当今获得多态性效率最高的分子标记，现已用于遗传作图、基因标记、DNA指纹图谱鉴定、遗传多样性分析等许多研究领域。

SRAP标记。SRAP（sequence-related amplified polymorphism）是由Li等发展的一种新的标记技术。该标记通过独特的引物设计对开放阅读框（opening reading frames，ORFs）进行扩增。一般而言，上游引物长17 bp，5′端的前10 bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，由此组成核心序列，再加上3′端3个选择碱基，可对外显子进行扩增；下游引物长18 bp，5′端的前10～11 bp是一段填充序列，紧接着是AATT，由此组成核心序列，再加上3′端3个选择碱基，可对内含子区域、启动子区域进行扩增。SRAP标记可以因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生有多态性的扩增产物，具有简便、稳定、产率高、广泛适用和便于克隆目标片段的优点，已经在马铃薯、莴苣、油菜、大蒜和棉花等植物研究中使用，并已被应用于遗传连锁图谱、转录图谱的构建以及比较基因组学和遗传多样性分析中。

CAPS标记。CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences）标记是特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记，它实际上是一些特异引物PCR标记（如SCAR和STS）的一种延伸。当SCAR或STS的特异扩增产物的电泳谱带不表现多态性时，一种方法就是用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性，用这种方法检测到的DNA多态性就称为CAPS标记。它揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，也表现为限制性片段长度的多态性。