分子遗传学的理论研究和DNA重组技术的发展，使得DNA分子上的直接定点诱变成了研究蛋白质结构与功能关系的有力工具。双氢叶酸还原酶是一个分子量低、三级结构已经搞清楚的重要酶蛋白。DHFR基因也已被分离和克隆，并测定了整个基因的核苷酸序列。
DHFR酶有上环、中环和下环三个活化中心环（图3-16）。美国加州大学克劳特（J.Kraut）研究小组在三个活化环中各选择了一个直接诱变点。
把下环的第27位天冬氨酸诱变为天冬酰胺，即去除了一个与酶的活化态的稳定有关的质子，代之以氨基，以观察质子转移能力和酶功能的关系。
把上环的第39位脯氨酸诱变为半胱氨酸，使新引入的巯基在氧化态时能和相对的第85位半胱氨酸形成二硫键，以观察在还原态和氧化态时酶功能的变化。
把中环的第95位甘氨酸诱变为丙氨酸，使原先的第95位和第96位连续两个甘氨酸形成的易弯曲段，变为新的丙氨酸-甘氨酸结构，以观察构型改变对酶活性的影响。
直接定点诱变的具体步骤如下（图3-17）。
（1）从克隆了野生型DHFR基因的质粒pCV79切取含有该基因的限制性酶切片段，整合于单链DNA噬菌体M 13mp8。
（2）合成含有诱变所需的变异碱基构成的寡核苷酸链，如将第27位密码子GAT（或GAC）变成为AAT（或AAC）
图3-16 双氢叶酸还原酶的立体结构示意（改自J.E.Villafranca）
图3-17 直接定点诱变实验示意
（3）将整合了DHFR基因片段的M 13mp8和特定的寡核苷酸混合，在55℃孵育5 min，再冷却退火到室温，使寡核苷酸和质粒上同源DNA片段形成互补双链片段。
（4）加入大肠杆菌的DNA多聚酶的大片段Klenow和噬菌体T4的DNA连接酶，以及各种三磷酸核苷苷酸（dNTP）。这时Klenow片段会以寡核苷酸为引子，以质粒DNA为样板复制出新的DNA。最后，部分完成复制的DNA经连接酶作用，又形成共价闭合的环状DNA分子（closed-circular double-stranded DNA，cc-DNA）。再用碱性蔗糖梯度离心去除未环化的半成品，得到纯化并浓缩的cc-DNA。
（5）用分离到的cc-DNA转染敏感菌JM 103，挑出噬菌斑。随后用点斑印迹杂交法（dot-blot hybridization）选出符合诱变要求的突变型噬菌体DNA
（6）用限制性核酸内切酶谱法或核苷酸序列测定法，确定DHFR基因的特定位点是否按实验要求发生了定向变异。一般来讲，直接定点诱变的效率为5%～30%，这是一般方法所不可比拟的高效率。
最后是对比野生型基因编码的DHFR酶和直接定点诱变基因编码的突变型蛋白在理化性质和生理功能上的异同。分析结果如下。
第27位天冬酰胺突变型蛋白和正常的DHFR酶（第27位天冬氨酸）相比，等电点从4.5变为4.8，电泳速度变慢，和甲氨蝶呤的结合力相似，但是酶活力只及野生型酶的10-3，即从野生型的每毫克蛋白50U降为每毫克蛋白0.05 U。表明第27位氨基酸因由天冬氨酸变为天冬酰胺而失去了一个和酶的活化稳定态有关的可转移质子，导致酶活力急骤下降。然而仅剩的t0-3酶活力又表明第27位天冬氨酸虽非常重要，但除此之外，可能还存在与稳定态有关的结构因素。
第39位半胱氨酸突变型蛋白比正常的酶多一个巯基，使它电泳速度变慢，但在还原态时两者的酶活力是相等的。然而，在氧化态时第39位半胱氨酸会和第85位的半胱氨酸形成二硫键，导致酶活力下降。表明二硫键改变了功能态的酶结构。
第95位丙氨酸突变型蛋白电泳速度比野生型酶显著减慢，酶活性全部丧失，表明野生型酶的一级结构中第95位和第96位连续排列的两个甘氨酸所形成的最易折叠的串联氨基酸结构的破坏会完全改变酶的构型，导致酶功能的丧失。
从DHFR基因直接定点诱变研究这个实例，可以清楚地看到这种方法已经成为研究蛋白质的结构和功能相关性的有力工具。诱变历来是遗传分析的主要手段，现在也渐渐成为生物化学和医学研究的有效实验手段。在后面几章中将讨论突变在研究基因功能的表达、遗传性疾病、免疫缺陷症、心血管疾患和癌症中的关键性作用。
最近几十年来，遗传学家已不再仅仅满足于在不同层次上研究突变的后果，即从DNA和蛋白质的结构变异和功能缺陷延伸到人遗传性疾病的诊断，而开始去探索从DNA受损到突变产生这一整套细胞反应的调控机制。环境诱变剂只是造成DNA分子的某种损伤（图3-18），如甲基化、嘧啶双聚体、无嘌呤位点或无嘧啶位点、嵌合或交联等，重要的是这些损伤究竟是通过一系列什么样的分子机制和细胞代谢过程演变为基因突变和染色体畸变的呢？这些分子和细胞水平的反应是怎样进行的？又是怎样受到不同层次的多重调节与控制的？每一个问题的研究都会面临科学与技术的严峻挑战。
图3-18 常见DNA损伤的示意
所幸的是，DNA重组和相应的活细胞分析等技术的广泛应用，使人们有可能把某些控制和调节损伤修复和突变发生的基因分离和克隆出来，并由此打开研究这些基因的结构、功能表达和遗传调控的路子。归根结底，深入研究这些基因及其产物与基因组、蛋白质组、转录组和细胞代谢组之间错综复杂的相互作用，才有可能最终阐明突变的全部过程。
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