关于离子通道的研究

心脏跳动、肌肉收缩、快速进行的思维等，都是生物电活动的表现。这有赖于细胞膜上一系列蛋白质的功能，这些蛋白质就是离子通道。离子通道的基本功能可以归纳为一句话：“孔”开放，离子通过“孔”流动，“孔”关闭。对离子通道基本机制的研究，就是研究“离子通过”这件事如何发生以及发生的后果，它对兴奋性细胞有何意义。这些问题仍然是神经科学领域中非常关键的问题。也许你会奇怪，经过那么多年的研究，这样一个简单过程难道还要再学习和再研究吗？还有可以研究的问题吗？［3］

离子通道这个概念曾经使得对神经系统电活动感兴趣的科学家为之倾倒，如果从1952年A. L. Hodgkin和A. F. Huxley发表他们的著名论文算起，科学家们研究这个问题已经60多年了。离子通道蛋白质是细胞膜上的“孔”，它对各种化学的或电的刺激作出开放或关闭的反应，这些结构使细胞可以充分利用储存在跨细胞膜两侧离子浓度梯度上的能量，以产生电信号；而这些信号的快速传导，则是神经和肌肉所依赖的。离子通道研究涉及神经科学领域里面的基本问题，如通道有什么物理学性质，离子是如何与通道相互作用的，药物与离子通道“孔”怎么相互作用，特定离子通道表达在哪里，又怎样在发育过程中或电活动中被调节，离子通道在不同类型的兴奋细胞上是如何工作的，等等。回顾20～30年来这个领域的进展，还可以提出某些未解决的问题以及今后的希望［3］。

通过最近的研究，得以阐明动作电位赖以产生的离子通道的分子结构，知道通道分子有什么特点。已经知道：它们可以分为若干超家族；离子通道可能有3种功能状态——开放、关闭、失活；钾离子通道有5个孔，仅中心孔是它的标志（signature）。我们还知道了离子通道的生物合成、组装、运输等。同时也应该看到，由于缺少药理学干预手段，如何把离子通道研究与脑疾病的治疗结合起来的问题还有待解决［3］。

离子通道的研究领域非常广阔，完全可以写一本书。对离子通道门控性质的研究，已经取得了重大进展。在本书范围内，我们只能集中在3个方面展开讨论的主题。①从早期对离子通道的一张卡通图模式，直到现在对离子通道的三维结构了解，推进了对它的分子性质的了解。②通过关于离子通道机制的一个故事来说明此机制对了解神经元信息传送的意义。这里，一个中心的课题是电压敏感。③讨论像离子通道这样一种复杂多成分的蛋白质复合体是如何组装起来，并发送到细胞正确位置的。这些是离子通道的基本问题，渗透到离子通道的所有生物学功能方面。了解这些方面，成为弄清离子通道在正常或疾病状态下如何工作的关键。此外，继续探索这些核心课题，对于发展操控通道功能的新方法，对于从事基础研究，发展新药物和治疗神经系统疾病都是必要的［3］。

要了解一个离子通道是怎样工作，怎样受调节，怎样与药物相互作用的，我们必须知道通道的构造。有关通道构造的基本看法是通过两种原型的通道研究而获得的。第一个原型是电压门控通道，它对钠或钾离子通透，从而产生动作电位的传播。第二个是五聚体的配基门控离子通道，即快速的化学突触通道，典型的就是烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）。本章主要目标集中在电压门控离子通道。想要了解配基门控离子通道，可以参看第3章［3］。

离子通道组成部分的基本概念如电压门控钠通道及电压门控钾通道，对这些我们都早就有所认识。这得益于高水平、高洞察力的生物物理学和药理学研究，知识是通过研究自然状态下的电压门控通道活动而取得的（图2-1a）。通道大分子是一种蛋白质，它是门控的，具有一个大的内前庭和一个小的外前庭的“孔”，两个前庭之间有一个狭窄的选择性滤过器。滤过器允许某些离子流动，其长度仅能允许同一时间有一个以上离子存在。但是它非常狭窄，离子在这里面走动的时候要排列成一排，不能并排走。门控的“门”在“孔”道的细胞内面这一侧，它受有关电压部件的调控，该部件埋藏在质膜内，能够感知跨膜电压的变化。当离子通道研究正进入分子领域的那个时候，许多报告的内容是鉴定和特征化那些已经得到很好研究的离子通道的基因。后来知道，这些基因是3个通道家族的成员：①电压门控离子通道（voltage-gated ion channel，VGIC）；②配基门控离子通道（ligand-gated ion channel，LGIC），如乙酰胆碱受体；③谷氨酸受体。这些鉴定基因的研究改变了整个领域的面貌，使研究者能够调整自己的研究工具，比如用定向突变方法、功能研究及化学标记方法等，来研究以前在自然细胞条件下所不能研究的问题。运用这类方法，人们能够探索某个氨基酸在通道中具体起什么作用。以上是在Neuron杂志刚开办时的1988年前后，离子通道研究的情景［3］。

图2-1　离子通道：从概念到结构（彩图见图版此处）

（a）离子通道的卡通模型，基于B. Hille在1977年对电压门控钠通道和电压门控钾通道的研究。此卡通包括了对于电压门控离子通道的基本了解。（b）无根树图，此图表明VGIC超家族最小“孔”区的氨基酸顺序。图中的亚家族有（顺时针方向）电压门控钙通道（CaV）、钠通道（NaV）、双“孔”（TPC）及瞬变感受器电位（transient receptor potential，TRP）通道、内向整流钾通道（Kir）、钙激活钾通道（KCa）、电压门控钾通道（Kv1—Kv9）、K2P通道、EAG家族电压门控钾通道（Kv10—Kv12）、环核苷酸门控通道（CNG）、超极化激活核苷酸门控阳离子通道（hyperpolarization-activated nucleotide-gated channel，HCN）。（c）细菌钠通道（BacNaV）的丝带模式图，除细胞内域以外，这个域经常是细胞因子修饰的位置，而且含有装配的分子域。所有（a）里面的关键和特征的部分，在这个模式图里都已具备。此图的核心部分根据2013年对离子通道晶体结构的研究。此模型是钠通道NaVAb和只有“孔”的钠通道NaVAe1p的综合图。图显示了来自2个膜亚单位和4个细胞内亚单位的诸元素。S4段中作为电压敏感器的精氨酸以空间充满模型表示。（d）从细胞外侧看PD-VSD域(3)交换的演示图。VGIC离子通道根据NaVAb，个别亚单位用不同的颜色相区分，有橘红色、青色、黄色、蓝色，选择性滤过器用紫色，紫色亚单位中标示了“孔”的域和电压敏感的域。（图引自［3］）

根据通道分子鉴定的研究结果，所展现出来的最重要分子组构原理是：电压门控钠通道（NaV）的跨膜部分、电压门控钾通道（KV）以及电压门控钙通道（CaV）的“孔”，它们都具有同一种装配方式，有关的亚单位都提供6个肽段（S1—S6(1)）；而其区别在于：在KV，S1—S6来自单个亚单位；在NaV和CaV，则来自成串的4个亚单位。这种构筑上的共性为研究一系列机制提供了背景。通过研究确定了，“孔”衬壁上的氨基酸残基是哪些，以及S4段电压感知器（voltage sensor）上的关键电荷在什么位置。这些及许多其他研究鼓励了模型的建立，模型把对膜看法的一些新观点都凝聚进去了。模型说明了特定氨基酸及其可能位置在特定的离子通道中为什么起这样的作用。虽然KV、NaV、CaV各自有与众不同的特点，而且流经它们的离子也不一样，失活和激活的特点也不一样，但它们的轴心分子结构是一样的。可以在一个基本框架下讨论它们的细节，如门控问题、选择性过滤问题以及电压感知问题等（图2-1a）［3］。

其他离子通道分子的鉴定结果出人意料。在大量不受电压调控的离子通道里面，都存在着组成VGIC轴心构造的跨膜脚手架部分。例如有一个相当大的家族，即不同TRP通道的家族，它们对温度、刺激物及其他感觉触发剂（sensory trigger）作出反应。这个家族都具有此轴心结构。此外，钾通道家族的两个分支——内向整流钾通道（Kir）及双“孔”域钾通道（K2P），都缺少S1—S4段，而仅含有类似KV的S4—S6部分的跨膜段。这些拓扑学上的区别，提示了形成“孔”和电压敏感两个域之间不同来源的功能差别，提示有一个强有力的进化路径可说明电压门控通道可能是如何发生的。后来又惊奇地发现，有两类具有S1—S4电压感知域但不连接到“孔”模块的膜蛋白，一类是电压敏感磷酸酶，另一类是质子通道。这些发现进一步强化一个观点，即从进化上看，VGIC家族的跨膜元素轴心是以一片一片的方式(2)组装产生的。也就是说，膜内存在着模块装置结构。现在，这种看法已得到晶体结构研究的强有力支持。研究显示，KV和细菌NaV都具有结构上不依赖的“孔”域（pore domain，PD）及电压感知域（voltage-sensing domain，VSD）。蛋白质切割（dissection）研究表明，PD及VSD都能够折叠而且单独操控。虽然这种模块式设计在溶解性蛋白质中早就被人知道，也是实现许多通道膜外域性质的明确的蛋白质原理，但是这种相平行的情况在膜内的VGIC中出现是令人惊奇的。这种模式结构可以把电压敏感性赋予那些原来并非内源性电压敏感的通道。还可以从中解析毒素的作用，即毒素如何靶向到特定NaV的VSD。进一步操控这种模块式结构，将会有很大潜力去激发潜在可能性，以使离子通道基因工程化，使得离子通道具有新特点，从而有利于发展新的合成生物学研究，调控神经元、肌肉细胞和其他的可兴奋细胞［3］。

于是人们就有了深刻认识。离子通道的核心功能是：对信号起反应，通道开放，然后离子沿着电化学梯度流动。除此以外，从对VGIC超家族树上不同分支的描述来看，那些连接于轴心共同跨膜拓扑学组成部分上的细胞内元素，有非常特殊而广泛的差别。在某些情况下，这些元素被认为具有可辨认的、可以感知代谢信号（例如环核苷酸和钙）的蛋白质域，此蛋白质域可以帮助整合通道活性，使之与细胞内信号事件联系起来。还有，与通道组装有关的细胞内域，被认为有与胞液内亚单位相互作用的位点。细胞外模块的分子变异也可以使基本跨膜“孔”的功能特点变得更为广阔。在构筑形式上的这种精心制作，使得一个通道可以对不同的信号具有敏感性，包括钙、磷酸化、蛋白质相互作用等。弄清楚输入信号如何被这些模式所感知而且传导到通道的跨膜部分上去，仍然是一个有待研究而问题未获解决的领域。此外，许多VGIC超家族的成员具有与已知折叠不相似的蛋白质折叠，其功能还不太清楚。了解离子通道的这些部分，可以帮助我们把通道轴心活性如何调控离子流动，与更为特异的其他活性联系起来，而这些活性又可以与特定细胞背景下的需要联系起来。聚焦到“整合性通道功能”这样一种看法，对于了解神经元的复杂细胞内信号网络是非常必要的。在这里，通道功能是与与其他分子活动相配合的，例如信号分子。这样就构成了电活动动态变化之全貌［3］。