离子通道记录方法

膜片钳技术最早由Neher和Sakmann报道用于研究肌肉乙酰胆碱兴奋性单通道（Neher and　Sakmann，1976），这一技术经近几十年来的改进，已成为目前研究细胞电生理的主要手段。膜片钳技术的应用，为在不同的研究领域发现新的离子通道和研究离子通道的通透性及动力学特性奠定了基础。

膜片钳的记录方法可分单通道膜片钳和全细胞记录两类。单通道膜片钳可用于记录细胞膜上单个离子通道的反应，常用来分析离子通道类型；全细胞记录方式可记录整个细胞在通道打开和关闭时离子电流的进出（电压钳）和膜电位的变化（电流钳），可用来研究离子通道的细胞生理学作用。膜片钳记录的主要原则在于将记录膜片上的电流和周围的干扰电流（记录溶液、电极、电场干扰等）分离。记录中，用一热抛光（fire－polished）的玻璃微电极，直接接触到细胞膜表面并施加一轻微负压，从而形成一上千兆欧姆的高阻抗封接（图11－1A），在这一条件下，细胞膜和记录电极的间隔在1nm以下，不但可减少记录电干扰，还可保证将记录膜片上的电流与周围细胞膜上的电流分开，从而记录到皮安（pA）级的膜电流变化。

单通道记录可采用细胞贴复式（图11－1B）膜内面－外向（图11－1C）及膜外面－外向式（图11－1D）记录方法。细胞贴复式为常用的单通道记录方法，记录时记录电极与细胞膜形成高阻封接，细胞保持完整。由于记录电极与细胞膜的阻抗非常高，可隔断电极与周围细胞膜的电流传导，因而仅有与电极内液接触的细胞膜上的电流被记录到，而不受周围膜电流的影响，从而保证仅记录非常小面积上的细胞膜离子通道（单个或多个离子通道）。贴复式记录的优点是记录相对简单，因而为单通道记录的常用手段。由于记录时细胞仍保持完整，细胞膜内的离子成分为细胞内液，因而无法根据实验需要而改变。为了控制细胞膜内外的离子成分，从而分析离子通道在不同离子浓度下的通透性，可在封接后将细胞膜从细胞上撕下，从而将膜内面暴露在细胞外液中，形成膜内面－外向的记录方式（图11－1C）。在此记录状态下，细胞膜内面的离子成分为细胞外液（记录液），可根据实验需要而改变，因而达到控制细胞内膜离子条件的需要。另一种单通道记录方式为膜外面－外向式（图11－1D），该记录状态是先吸破细胞膜，再将小片细胞膜撕扯下，撕扯下的细胞膜可重新封接到记录电极上，从而形成细胞外膜朝向细胞外液，细胞内膜朝向电极内液的记录方式。在该种记录方式下，细胞膜外膜的离子成分为细胞外液（记录液），可根据实验需要而改变。

图11－1　单通道记录

图11－2　全细胞记录方式

单通道记录的主要目的是将离子通道单离出来研究，要想分析离子通道在细胞生理上的功能，记录在离子通道打开或关闭时对整个细胞的反应的影响，则需要采用全细胞记录方法（图11－2A）。全细胞记录方法是在形成高阻封接后，进一步施加负压吸破细胞膜，从而使电极内液与细胞内液连通，达到记录整个细胞膜电流的密度（图11－2B）。离子通道有许多种，主要属于电压依赖性或配体依赖性（ligand gated）通道，常采用改变钳制电压和施加受体阻断药或兴奋剂研究。有的离子通道受其他因素控制，例如耳蜗毛细胞的纤毛上存在一种独特的离子通道，受机械刺激控制，属牵拉控制性通道（stretch channel，也在果蝇翅膀上表达），是控制毛细胞的兴奋性的主要通道。