细胞与生物材料复合的检测

组织工程最基本的元素即细胞及支架材料，目前机体绝大多数组织细胞均可在体外培养。细胞在体外培养条件下形态、生长和功能可能会发生变化，在细胞和材料复合过程中，以及将复合有细胞的材料植入体内后，须检测细胞形态和功能的变化，只有保证体外培养的细胞不仅能快速增殖，而且能保持其特有的功能，才是真正的组织工程构建技术。

一、细胞形态学观察

细胞形态学观察最基本的就是在倒置显微镜下对活细胞进行观察，在普通倒置显微镜下显示的是平面图形，可用相差显微镜观察细胞的立体形态。另外可对细胞进行固定染色，更易于观察细胞形状，细胞核及细胞质。

细胞在接种和传代后，根据实验需要和细胞种类须对细胞进行常规检查，如是否污染，培养液pH及细胞生长状况等，及时掌握细胞动态变化并对症处理。

1．微生物污染　细胞培养操作不当或材料的灭菌不严格，常常会发生细胞－材料复合物的污染。常见的污染源有细菌、真菌、支原体、病毒等。细菌污染较易发现，常引起培养液浑浊，在显微镜下观察常见葡萄球菌，大肠杆菌等。真菌污染也较易发现，肉眼即可见到真菌菌落漂浮于培养液表面，有些在光镜下可见丝状，瘤状或树状菌丝。念珠菌或酵母菌形态呈卵圆形，散在于细胞周边和细胞之间。

支原体污染不易被察觉，培养液不浑浊，多数细胞无明显变化，或有微细变化，可因传代或换液而被缓解。实验证实，支原体可抑制骨髓瘤细胞生长，降低融合率；有DNA活性的支原体能降低DNA合成；需尿嘧啶型的支原体影响RNA合成；需精氨酸型的支原体则快速消耗培养液中的精氨酸，影响细胞DNA合成。各类细胞对支原体的耐受性和反应性都有差异。

2．光镜观察　由于大多数材料在显微镜下是不透光的，在材料较厚的部位一般是无法观察到细胞形态的。在材料边缘或孔隙内，可见生长状态良好的细胞在倒置显微镜下均质、明亮、透明度大，折光性强，轮廓不清。

3．固定染色观察法　细胞固定的目的是迅速终止组织内各种酶的活性。防止细胞自溶并保持组织细胞的形态结构，使细胞内化学物质和酶能准确定位。细胞染色方法分为一般染色和特殊染色，一般染色为观察细胞一般形态，特殊染色用于观察细胞的特殊成分和结构。一般常用的染色法有Giemsa染色法，苏木精－伊红染色法等。

二、组织化学和细胞化学

组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）染色是通过化学反应的原理，研究组织或细胞内某种结构的化学组成的定位、定量。基本原理是在组织切片或细胞样品上加一定试剂，该试剂与组织内的某种成分起化学反应，形成有色终末产物，在光镜下，研究糖、脂、蛋白质和酶，核酸等在组织或细胞内的分布。

例如用孚尔根反应（feulgen　reaction）显示脱氧核糖核酸（DNA）；过碘酸－Schiff反应（periodic　acid　schiff　reaction，PAS）显示组织内的多糖和黏多糖成分；脂溶性染料如油红O（oil　red　O）等显示脂类，以及各种酶细胞化学染色显示的胞内酶的活性，而不是酶本身。

三、免疫细胞化学

免疫细胞化学（immunocytochemistry）和免疫荧光（immunofluoresence）是应用抗原抗体结合原理，检测细胞内多肽，蛋白等大分子物质的分布。这种方法的特异性强，灵敏度高，近年来发展迅速，应用广泛。尤其是单克隆抗体（monoclonal　antibody）技术的应用以及标记技术的不断改进和灵敏度的提高，使此项技术的进展日新月异。免疫酶标法最常用的是辣根过氧化物酶（horse－radishperoxidase，HRP），它的底物是3，3’－二氨基联苯胺（DAB）和H2O2，HRP使DAB氧化形成棕黄色沉淀。免疫荧光法最常用的是异硫氰酸（fluorescien　isothiocyanate，FITC），抗原与该荧光抗体复合物在镜下呈黄绿色荧光。

放射免疫分析（RIA）是根据放射性核素的敏感性和抗原－抗体反应的特异性两大特点综合起来建立的一种检测技术，其基本原理是标记抗原（Ag＊）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争性结合，标记与非标记的抗原与抗体的结合能力是相同的，随着非标记抗原量的增加，标记抗原被稀释的程度随着增加，继之形成的标记抗原－抗体复合物的数量减少，放射性强度就减低。

在放射免疫分析方法中，常用的核素包括3　H，125I和131I等。3　H是弱β衰变，能量弱，易于防护，衰变周期长，但标记需一定的设备和条件；125I的半衰期较短，在放免分析时，常用125I标记抗原。目前市面上有各种放免试剂盒出售，可根据需要和试剂盒说明书进行选用和操作。

四、电子显微镜观察

若需对培养细胞或复合到材料上的细胞进行超微结构观察，应选用电子显微镜。超微结构观察有助于更确切地了解细胞形态特点，如微绒毛的形态，多少，桥粒的有无，微丝、微管、核仁的形态和数量及排列等。电镜分为透射电镜（transmission　electron　microscope，TEM）和扫描电镜（scan　electron　microscope，SEM）。根据培养细胞的种类和培养方法不同，电镜观察可分为原位观察和消化分离观察。

1．透射电镜观察　透射电镜标本制作须经过固定、包埋、切片、染色等步骤，体外培养的细胞盖片也需经过固定、染色。透射电镜是以电子束为光源，穿透力低，而放大倍数和分辨率比光镜大得多，标本以戊二醛，多聚甲醛，锇酸等固定，树脂包埋，切片（850～80nm超薄切片）。醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色后，形成黑白反差。被重金属染呈深黑色的结构称电子密度高（electrondense）、浅色的结构称电子密度低（electronlucent），这种染色称为正染（positive　staining）。若被检组织不着色，而其周围部分被染色黑色，则称负染色（negative　staining）。

2．扫描电镜观察　扫描电镜是用来观察细胞和组织的表面结构。样品制备较简单，组织固定后勿需包埋与切片，在真空镀膜仪内干燥后，于组织块表面或盖片培养的细胞表面先后喷镀一层碳膜和合金膜，即可于镜下镜检。扫描电镜的景深长，样品表面的金属膜可提高其导电性和图像反差，呈现富有立体感的表面图像，如细胞表面的突起，微绒毛，纤毛和细胞的分泌或吞噬行为等。

五、细胞骨架观察

一个真核细胞的胞质部分（往往指细胞在去除其亚细胞的结构组分——包括线粒体和内质网及核微粒等成分后，残留下的可溶性部分），往往尚含有20%～30%高浓度蛋白质溶液，各个蛋白质之间具有弱的相互作用力。这些蛋白质可导致细胞内水形成两个部分，即水化的结合水分子与蛋白分子表面结合以及自由水。这些细胞质中的由蛋白丝组成的非膜相结构统称为细胞骨架（cy－toskeleton），根据目前的研究，按纤维直径的大小又可将其分为微管（microtube，直径约24nm）、微丝（microfilament，直径为5～8nm）、中间纤维或称中间丝（intermediatefilament，直径为7～12nm）以及比微丝更细且不规则的纤维网，称为微梁格（microtrabecularlattice　system，直径＜6nm）。细胞骨架蛋白在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及纤维细胞形态方面具有重要作用。常见的观察细胞骨架的方法包括鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法，抗管蛋白免疫染色法，考马斯亮蓝（coomassie　bright　blue）法等。

六、细胞生长能力检测

细胞与材料复合后，材料对细胞的生长有无影响，是评价材料细胞相容性的重要指标，常通过定时细胞计数或四唑盐（MTT）比色法绘制细胞生长曲线。

采用流式细胞仪检测细胞周期和DNA合成，是评价细胞－材料相互关系的较理想指标。常用流式细胞仪来测定细胞周期各时相的细胞比例，同步分析细胞内DNA、RNA、蛋白质的含量。也常用来测量细胞表面的荧光免疫标记，对细胞进行分类鉴定及功能测定。

七、细胞遗传性状检测技术

对培养细胞进行遗传学检测，除了传统的染色体核型分析，染色体显带技术，姊妹染色单体交换，染色体原位杂交等，近年来染色体荧光基因标记法等得到了迅速发展，可根据需要选用。

八、细胞功能检测

在组织工程研究中，不仅要求体外培养的组织细胞、细胞和材料复合后保持正常的形态和生长能力，正常的遗传性状，还要求不同组织细胞具有特定的功能。

特异性功能指标的检测可以从几个方面加以考虑，首先特异性的功能一般表现为细胞内特异蛋白质的存在及活性水平。如果该蛋白本身就是酶，可以直接用生化测定仪测定酶的活性。例如磷酸肌酸激酶在骨骼肌中含量很高，但它们并不存在于肝内。如果该蛋白并非具有酶活性，但可以表现一定的抗原性，可用于制备相应的抗体，用相应的免疫学方法来检测。根据实验条件和蛋白种类，还可以选用荧光免疫或放射免疫的方法进行定量测定。如果该蛋白可以被某些染料直接着色，即可以用一般的组织化学方法作定性检测。另一方面随着分子生物学的发展，很多功能蛋白的DNA序列已清楚，我们可以通过RT－PCR或Northern的办法来鉴定细胞内是否有特异性蛋白质的mRNA的表达。随着基础研究的深入和研究手段的发展，将会有更多特异性的功能检测指标被发现和更多的检测方法被应用。

（四川大学华西医院　谢慧琪）

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