常规种子细胞与支架材料的接种复合技术

一、细胞接种前的准备

1．制备细胞悬液　按照构建不同工程化组织，选择合适的种子细胞制备细胞悬液。细胞经多次传代后要发生老化，在选择细胞时，要注意选择合适的代次，如软骨细胞一般在传代5代以后其形态、功能均发生改变，宜选择4代以前的细胞制备细胞悬液；肌腱细胞在传代13代以后出现分裂增殖能力降低，构建组织工程肌腱宜选择12代以前的细胞。为了使研究更具有可比性及同一性，在研究中，最好选择同一批次的同一来源的细胞完成全部研究过程。目前已有10多种正常组织细胞建立了细胞系，如昆明医学生物研究所建立的人胚胎肺组织KMB细胞系，属成纤维细胞型；卢辉增等建立的兔主动脉内皮细胞R43E细胞系，属扁平多角上皮型；柯杨等建立的人胚胎胃上皮GES－1细胞系，属上皮型，由SV40转化而来。四川大学华西医院用SV40大T抗原温敏型质粒ptaA58H转染，建立的人胚胎肌肌腱细胞系，属成纤维细胞型。国外，由Fogh和Lund用新生儿羊膜建立的FL细胞系，属上皮细胞型；由Chang建立的人肝脏Chang细胞系，属上皮样细胞型；由Hayflick建立的人胚胎肺组织W1－38细胞系，属成纤维细胞型；由Nichols等建立的人胚胎肺组织1MR－90细胞系，属成纤维细胞型；由Reznikoff建立的C3H胚胎小鼠C3H10T1／2细胞系，属成纤维细胞型；由Todaro和Green建立的Swiss胚胎小鼠3T3－90细胞系，属成纤维细胞型；由Aaronson和Todaro建立的Balb／C小鼠Balb／3T3细胞系，属成纤维细胞型；由Hartly建立的Swiss胚胎小鼠NIH3T3细胞系，属成纤维细胞型；由Gluzman建立的美洲绿猴肾组织Cos－1细胞系，属成纤维型等。近几年还建立了一些新的细胞系，为组织工程研究提供了标准细胞，但种类仍然很少，不能满足组织工程研究的需要。从已建立的细胞选择作为组织工程的种子细胞制备细胞悬液，可免去细胞生物学的研究过程，节省时间，节省金钱，且能保证研究的同一性和可比性。

2．支架材料的准备　根据构建不同的工程化组织，选择不同的支架材料，如构建工程化肌腱，宜选择有一定力学强度、可降解的以纵向纤维编织成形的材料或生物衍生肌腱材料为好；构建工程化骨宜选择具有一定孔隙率、孔径大小及良好孔间交通的，有机与无机材料的复合型支架，或生物衍生骨支架材料；构建工程化软骨宜选择可完全降解的PGA或其改性处理物，复合生物衍生材料如胶原与几丁糖或玻璃酸钠或糖胺多糖等复合。

对于支架材料的选择不仅要考虑材料的成分、结构，还应考虑到材料的几何形状、大小、表面形貌、孔隙率、孔径、孔间交通、生物力学强度、降解性能、pH、亲水或疏水性等。

在细胞接种之前，材料除应严格消毒灭菌外，一般均应做预湿处理，使材料吸附一定量的水分。如果材料含水量过大，要影响细胞悬液接种的有效率，如果不经预湿处理，细胞悬液接种在材料上不能存活。对材料的预湿程度需在研究中摸索，根据构建不同工程化组织的需要进行材料的预湿处理。

3．其他准备　细胞与支架材料的联合培养可以在孔板、培养瓶、各种动态培养系统内进行，根据研究目的不同，选择培养方式，并准备好各种培养器皿和设备。

二、细胞与支架的接种技术

细胞与支架材料复合培养方法并不成熟，是一个尚待研究的问题。在复合培养中，除了要求支架材料有很好的细胞相容性以外，还希望细胞能更多地接种在支架材料上，并能牢固地附着在支架材料上，并且还能继续分裂、增殖及发挥生理功能。构建不同的工程化组织，需采用不同的细胞接种方法。较为通用的方法如下。

1．浸渍法　预先制备好高密度细胞悬液，将已经过预湿处理的材料置入细胞悬液中，由于材料对细胞有良好的相容性，细胞逐渐向材料迁移，并附着在材料上。这种方法适用于非贴壁生长细胞，对细胞具有趋化性的生物材料，及采用玻璃培养皿进行细胞培养。这种静态培养方法的优点是操作简单，不易导致污染，对设备、仪器的要求不高。缺点是接种细胞的数量有限，接种率低，很多细胞被浪费。如果采用动态悬浮培养系统，则可大幅度提高细胞的接种率及细胞接种的均匀度，更有利于工程化组织的形成。

2．沉淀法　又称接种法，是最为常用的方法。包括一次沉淀法、二次沉淀法。前者是将已预湿的支架材料置于培养皿中，制备高密度细胞悬液，用吸管将细胞悬液缓慢逐滴滴加于材料上，不使细胞从材料上溢出，放置培养箱中2～4h，待细胞充分黏附于材料后，缓慢加入培养液进行复合培养。后者是采用上述方法，先沉积部分细胞到三维支架中，孵育一段时间（1～2h），使细胞黏附到材料中，然后再加入剩下的部分细胞，在37℃条件下孵育（1～2h），产生种子细胞的第二次沉淀，以增加种子细胞沉积黏附的数量。还可采用多次沉淀的方法，使黏附在材料上的细胞数量增加。这种方法的优点是操作简便，可提高细胞的接种数量。缺点是接种的细胞分布不均匀；如果支架材料为筛网状，接种的细胞有可能从网孔中漏出，影响接种细胞的有效率。如果接种细胞速度过快或量过多，细胞可从支架材料上溢出，影响细胞的接种数量。这种方法最适合用于底部为致密结构，表层为网状结构的支架材料，如带皮质骨、松质骨的材料，在松质骨网架上接种细胞，皮质骨可防止细胞漏出。

3．吸附法　这是近几年才采用的一种接种细胞的新技术。一般采用负压吸附法，将已预湿的支架材料置于培养皿中，用吸管将高密度细胞悬液逐滴滴加于材料上，或将支架材料置于细胞悬液中，将整个培养皿置于负压容器中，施加一定的负压吸引力，细胞被负压吸附在支架材料上。该方法有利于细胞充分接触并黏附于材料内部，适用于支架材料孔径、孔隙率相对较小，细胞不易通过孔隙交通进入材料内部的情况。优点是细胞接种较为均匀，数量较多，不导致细胞浪费。缺点是负压吸引的压力不易掌握，负压力太大，有使细胞死亡的可能；负压力太小，又不能使细胞吸附在材料上，这需要针对不同的支架材料及细胞种类，反复试验，寻找一种吸附率高，不导致细胞破坏的最佳方法。此法的惟一缺点是容易污染。

4．凝胶法　将高密度细胞悬液与多种物质，如胶原、藻酸钠、几丁质、玻璃酸纳等按一定工艺复合，形成凝胶，凝胶所具有的三维孔隙结构为细胞提供了生存空间及代谢活动场所，细胞能较均匀地分布在凝胶内。这是一种较常用的细胞接种技术。

根据所选材料不同，细胞形成凝胶的技术也有差别。下面以成骨细胞与藻酸盐凝胶的制备为例，简要说明凝胶法的制备过程：

取藻酸钠干粉（Fluka公司产品）配制成1．5%溶液，pH调至7．2，120℃高压消毒30min，4℃保存备用。

取成骨细胞悬液1×107／ml细胞，加入1．5%藻酸钠溶液，再加入葡萄糖酸钙，使钙浓度为50mmol／L，混匀，即形成凝胶。在一项用此法构建的组织工程骨修复兔桡骨1cm缺损的动物实验中证实，实验组全部达到骨性愈合；对照组采用单纯细胞悬液注射，25%不愈合。

5、动态培养系统　将支架材料浸没在高密度细胞悬液中，采用旋转培养系统，可使细胞更均匀，更多地附着在支架材料上。目前已有多种动态细胞培养装置可供选用。