多种细胞与生物材料的复合

人体的大多数组织、器官是由多细胞及细胞外基质成分组成的，因此，在组织工程研究中，应考虑到涉及多细胞构成组织或器官的构建，即多细胞与生物材料的复合问题。目前国内组织工程研究热点主要集中在单一细胞或主要功能细胞构成的组织上，如骨、软骨、肌腱、角膜等。但随着组织工程研究工作的逐渐深入，必将有更多复杂功能、含多细胞组织或器官的工程化构建研究开展。皮肤是比较简单的多细胞复合构建的组织，在国外研究较多，美国FDA已批准上市。下面以皮肤为例，简单介绍多细胞与生物材料的复合技术，详细内容在本书其他章节中重点介绍。

一、角质形成细胞与成纤维细胞

的复合培养法

皮肤由表皮与真皮组成，表皮中大部分为角质形成细胞，具有活跃的细胞分裂能力。真皮主要由致密结缔组织构成，主要细胞成分是成纤维细胞。

所谓复合培养是模拟角质形成细胞在体内的生长环境，将细胞种植在真皮组织的替代物上，待细胞长满融合时，将上皮细胞表面暴露在空气当中，进行液气平面培养，促使培养细胞在这种模拟的生物条件下得以完全生长分化。该方法不但有利于表皮细胞的生长和分化，形成类似体内的皮肤组织结构，如颗粒细胞层、角化细胞层等。而且在真皮组织替代物上种植形成的皮片，其强度、弹性和黏附性与正常皮肤十分相似，可用于临床上烧伤创面的覆盖与治疗。目前，真皮替代物主要有两种，一种是人去表皮真皮（de－epidermised　dermis，DED）；另一种是真皮替代物，即成纤维细胞与胶原蛋白制成的复合物膜。下面着重介绍后一种方法。

1．主要实验材料

（1）材料来源：人皮肤或新生Wistar大鼠背部皮肤。

（2）培养用液：①成纤维细胞培养液：为DMEM培养基添加10%～15%新生小牛血清；②角质形成细胞培养液：为DMEM与F12的混合培养基，按3∶1（V／V）比例混合，添加10%小牛血清、4mmol／L谷氨酰胺、0．4mg／ml氢化可的松、10－10　mol／L霍乱毒素、5mg／ml转铁蛋白、1．8×10－4　mol／L腺嘌呤、2×10－11　mol／L三碘甲状腺原氨酸、5 μg／ml胰岛素和10ng／ml表皮生长因子以及100U／ml青霉素和100μg／ml链霉素；③消化液：消化液包括浓度为1　000U／ml中性蛋白酶、0．25%胰蛋白酶溶液和0．25%胶原酶溶液，使用时添加100U／ml青霉素和100mg／ml链霉素；④10%胎牛血清的DMEM培养液。

（3）胶原膜的制备：将鼠尾胶原液与10× DMEM以及0．34mol／L　NaOH按8∶1∶1的体积比快速混合，并立即吸加到24孔培养板中（每孔1．0ml）。放置30min，待其凝固后，将贴附于底面的凝胶与培养板分离，备用。

（4）培养器具：200目尼龙网、无菌注射器针头等。

2．复合培养方法

（1）经浸泡消毒后，取新生Wistar大鼠背部皮肤，尽量仔细去除皮下组织。

（2）将皮肤材料切成0．5cm2大小的组织块。

（3）加入一定量的中性蛋白酶消化液，于4℃下消化20h。

（4）用无菌针头分离真皮与表皮。

（5）将分离的表皮条用胰蛋白酶溶液5ml在37℃振荡消化10min。然后，弃去酶溶液。再加入15ml的含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，并除去漂浮的表皮皮片。

（6）将分离的真皮用胶原酶溶液5ml于37℃下消化30～40min，弃酶溶液。再加入15ml含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。

（7）上述表皮和真皮分离细胞的悬浮液分别用200目筛网过滤。将过滤液离心洗涤（1　500r／min，2min）3次。

（8）细胞计数。首先以2．0×105个／cm2的细胞密度，将真皮细胞悬液接种于培养板中的胶原膜上。用添加含15%新生牛血清的DMEM培养液，在37℃下，5%CO2的条件下培养48h。

（9）将胶原膜反转180°。在胶原膜的另一面以4．0×105个／cm2的细胞密度，再将表皮细胞悬液接种其上，用角质形成细胞培养液进行培养。

（10）隔日更换培养液。1周后改用液气界面培养。根据所选用培养瓶、板的大小，加入一定量的培养液，须注意将角质形成细胞种植面的胶原膜暴露在空气中为准。

注意事项：胶原膜的制备对角质形成细胞与真皮纤维细胞的复合培养至关重要。制备的胶原膜须有一定的网眼，以利于真皮成纤维细胞和角质形成细胞间的相互作用，促进细胞的分化。对于胶原膜网眼大小的调节，可以通过改变鼠尾胶原与NaOH的配制比例来影响胶原膜形成网眼的大小。胶原的浓度不能过低，一般应在1mg／ml以上。这样形成的胶原膜较厚，利于以后接种角质形成细胞。胶原膜最好固定于不锈钢网架上，这不仅有利于胶原膜双面细胞种植时膜的反转自如，而且也有利于在进行液气界面培养时，控制加入培养液的量以形成适宜的液气界面。此外，可以将鼠尾胶原与以一定细胞密度分离培养的成纤维细胞混合，制成细胞胶原蛋白混合物，与角质形成细胞一起共同培养。

3．结果　真皮成纤维细胞与角质形成细胞复合培养的第1周，表皮培养细胞扁平，呈单层附于胶原膜上；成纤维细胞少而呈梭形。在第2周，角质形成细胞层数增加，细胞开始分化，但细胞分界不清；成纤维细胞生长呈网状，其周围出现基质样物质。在第3周，细胞分化明显，出现基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质细胞层。基底层细胞多角形，颗粒层细胞扁平，胞质中可见嗜碱性透明角质颗粒；成纤维细胞数量增多，细胞外基质增多。到了第4周，表皮已具有较完整的角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，与正常鼠皮肤结构相似。

二、中空纤维细胞培养技术

细胞在活体内生存的空间是一种立体的三维空间，不同细胞以多层的形式相互堆叠形成组织。在体条件下广泛存在于细胞周围的毛细血管对维持组织内部高密度状态下生长的细胞的物质代谢条件起到了非常重要的作用。毛细血管为在立体环境中生长的所有细胞提供营养和物质供应；同时，运输组织内部细胞的代谢产物。使细胞始终生活在不断更新的营养环境之中。

中空纤维细胞培养技术（hollow　fiber culture　technique）就是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细血管”，即中空纤维束为培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。

中空纤维细胞培养系统的核心装置是中空纤维反应器，一般为圆柱体结构，内面封装中空纤维，侧壁上有接种和收集细胞及其产物的开口。中空纤维是一种细微的管状结构，一般是乙酸纤维素、聚氯乙烯－丙烯复合聚合物、多聚碳酸硅、聚砜或聚甲基丙烯酸甲酯等材料制成。中空纤维的外径一般在100～500μm不等，管壁厚度为25～75μm，管壁呈多孔的海绵状。在每一根中空纤维管壁的内表面都衬贴一层超滤膜，不同规格的中空纤维内表面的超滤膜允许透过分子量不同，有不同规格，根据实验需要而定。中空纤维的构造形式类似于动物组织内的毛细血管，其外径大小、管壁厚薄、管壁超滤能力等参数都可以根据培养要求而选择。细胞接种在中空纤维反应器套管内表面与中空纤维之间的空间。

整个中空纤维培养系统还有储液器、供氧器、蠕动泵以及连接各附件的硅胶管。混合气体供应装置用于给培养液通入空气和5%CO2混合气体，蠕动泵用于推动培养液流过中空纤维反应器并进行循环利用。整个系统连接好之后，开启蠕动泵，培养液就会源源不断的流过中空纤维反应器，并在各个附件之间循环，给所培养的细胞运送营养物质和带走代谢产物。中空纤维细胞培养系统为体外培养细胞提供了一个近似生理条件的体外生长微环境，在这种培养条件下，细胞可以不断增殖和生长，形成类似活体组织的多层细胞培养物。中空纤维细胞培养技术可用于培养多种动物细胞，也可以生产多种生物制品，如单克隆抗体、酶、激素、细胞因子等。