细胞污染的检测与排除

细胞污染的检测与排除_动物细胞培养技术

任务4　细胞污染的检测与排除

培养细胞被污染是动物细胞培养工作的大敌。从一开始培养细胞就要十分重视污染问题，否则会前功尽弃。大量的实践证明，除需要完善的实验设计和技术方法外，动物细胞培养成败的关键往往在于能否避免污染，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一，因此每一位动物细胞培养工作者都要始终注意防止培养的细胞被污染。

培养细胞的污染不仅仅指微生物，而是指所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，一般包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）及细胞（非同一种的其他细胞）。考虑到微生物污染在实际工作中比较常见，本任务将着重介绍微生物污染的检测和排除。

一、细胞污染的检测

由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗生素的抗污染能力也是很有限的，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如果能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。当污染物持续存在于培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞浆出现较多的颗粒状物质；重者细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现大量的堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。

不同的污染物对细胞的影响也有差别。微生物中支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的；真菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质以杀灭细胞。

（一）细菌与真菌的污染检测

由于环境条件差和操作不当等，常发生细菌和真菌的污染。常见污染的细菌有革兰氏阴性菌如大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰氏阳性菌如葡萄球菌等。真菌污染也常发生，尤其在炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛真菌、孢子菌等。真菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有毒物质以杀死细胞，镜下可见细胞浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。真菌污染容易被发现，大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝纵横交错于细胞之间。细菌污染较严重时培养基上清液混浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。

抗生素及抗真菌制剂对预防或排除细菌、真菌污染均有效。工作中要特别注意和防止所用培养液和血清的污染，应仔细检查是否混浊和有无菌丝存在，以防止在培养细胞时造成污染。

（二）支原体污染检测

支原体是细胞培养中最常见的，又是干扰实验结果的一种污染。但由于不易被察觉，这些污染的细胞仍在继续使用。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到了支原体的污染。因此，对支原体的污染必须严加防范，并应熟悉支原体的基本特性。

支原体是一种介于细菌和病毒之间，并能在细胞外独立生存的最小微生物，它无细胞壁，形态呈多形性，最小的直径为0.2μm，可通过滤菌器。在购进的各种血清中就有支原体存在。细胞污染后，因支原体无细胞致死毒性并可与细胞长期共存，培养基一般不发生混浊，细胞无明显变化，外观上往往给人以“正常”的感觉，实际上细胞能受到支原体多方面的潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA的合成，以致抑制细胞的生长。

为了确证细胞是否被支原体污染，可做如下检测。

1.显微镜检查

（1）相差显微镜检测。

取洁净载玻片，滴加少许待检测的细胞悬液，压上盖玻片。置相差显微镜油镜下观察，支原体呈暗色微小颗粒，有类似布朗运动，位于细胞表面和细胞之间。注意支原体与细胞破碎后溢出的细胞内容物（如线粒体等）颇为相似，应加以区别。

（2）地衣红染色法。

本法为固定染色法，简便易行，标本可长期保存，不仅适用于检测支原体，也可用于检测真菌和细菌。

①取材：取用盖玻片培养细胞或培养液，用培养液时，先吸取培养液1mL，500～800 r／min离心5min后去上清液，留0.2mL备用。

②低渗处理：用新鲜配制的0.45%柠檬酸溶液处理盖玻片细胞或加入0.2mL上述培养液中，低渗处理10min。

③固定：用新配Carnoy液固定2次，共10min，取出盖玻片晾干；培养液则离心去上清液，余沉淀物0.2mL，制涂片2～3张。

④染色：用2%醋酸地衣红染色5min。染液配方如下：

地衣红　　　　2g

冰醋酸　　　　60mL

加蒸馏水至　　100mL

支原体和细胞被染成紫红色，如染色过深可用75%酒精脱色。

⑤封片：纯酒精过3次，每次1min，用封固用胶或树胶封片。

（3）荧光染色法。

荧光染色法为荧光染料染色后用荧光显微镜检查的方法，荧光染料用Hoechst 33258，它是一种能与DNA特异性结合的荧光染料，支原体含有DNA，能着色。

①标本：汇合前从瓶中取出盖玻片培养的细胞，如细胞完全汇合，会影响对支原体的观察。

②漂洗：将细胞盖玻片置于培养皿中，用不含酚红的Hank′s液漂洗；细胞悬液则先离心去上清营养液后，再加入Hank′s液洗涤。

③固定：用醋酸-甲醇（1∶3）溶液固定10min。

④漂洗：用生理盐水或去离子水漂洗。

⑤染色：置于Hoechst　33258中染色10min。Hoechst 33258用不含酚红的Hank′s液或生理盐水配制，浓度为50μg／mL。

⑥漂洗：用蒸馏水漂洗1～2min，处理方法同步骤②。

⑦观察：取出细胞盖玻片，滴pH　5.5的磷酸盐缓冲液数滴，再覆以盖玻片，置于荧光显微镜下观察。细胞悬液则先离心，去上清液，加3～5滴上述磷酸盐缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重新悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，覆以盖玻片后观察，荧光显微镜下可见支原体呈亮绿色小点，散在细胞周围，或附于细胞膜表面。

2.支原体的培养

为了进一步深入研究支原体，可采用Hayflick琼脂培养基分离培养。

（1）Hayflick琼脂培养基的成分。

成分Ⅰ：牛心浸出液　　　　　1000mL

　　　　氯化钠　　　　　　　5g

　　　　蛋白胨　　　　　　　10g

　　　　琼脂粉　　　　　　　14g

成分Ⅱ：无菌小牛血清或马血清（不灭活）20mL

　　　　25%鲜酵母浸出液　　　　　　10mL

　　　　1%醋酸铊　　　　　　　　　　2.5mL

　　　　青霉素G（20万单位／mL）　　　　0.5mL

　　　　20%无菌葡萄糖溶液　　　　　5mL

（2）制备方法。

①牛心浸出液的制备：将牛心（公畜为好）400g绞碎，浸于1000mL水中3h，煮沸20min，待冷却后置于4℃过夜，去除浸出液表面的脂肪，过滤，补足水分至1000mL。加入蛋白胨、氯化钠。加热溶解后，调节pH值至8.4～9.0，通蒸汽加热2h，使磷酸盐沉淀。用滤纸过滤，再用HCl溶液调节pH值至7.8。加琼脂粉14g，于121.3℃、103kPa灭菌15min。

②待成分Ⅰ冷却至80℃，加成分Ⅱ，混匀后倾注培养皿。

接种上述培养物，置于37℃培养箱，连续观察一周，其支原体集落为微小集落，须仔细观察，必要时用放大镜观察，典型者为油煎蛋样菌落，进一步可用发酵葡萄糖、利用精氨酸、水解尿素等性能进行初步鉴定。

（三）潜伏病毒的污染检查

已知有些常用的传代细胞上带有潜伏病毒，如HeLa细胞带有人乳头瘤病毒（HPV-18型）DNA，尤其是疱疹病毒、乳多空病毒科等DNA病毒及逆转录病毒常以前病毒的形式整合在细胞染色体中或以质粒形式存在于细胞浆中，随细胞分裂可传到子代细胞中，因此应用细胞进行实验时必须心中有数，知其所携带的潜伏病毒。另外，常用动物组织进行细胞培养，在培养的细胞中本身就可能存在潜伏病毒，在进行某种未知病毒的分离鉴定时，常混淆了视线，得出错误的结论，如将鼠痘病毒、鼠脱脚病病毒等当成要分离的病毒，故应注意潜伏病毒的检查。

1.细胞的直接观察

（1）对细胞培养状况经常观察，如细胞贴壁繁殖的速率、形态、代谢活性等。

（2）对每10代细胞培养物或需要培养的细胞进行红细胞吸附实验，以检测带有血凝素的病毒。

（3）必要时应做包含体检查。

2.动物接种检查

（1）将疑为病毒污染的细胞制备成10⁷个／mL细胞悬液。

（2）动物接种：常采用乳鼠或成龄小白鼠的脑内或腹腔接种疑为污染的细胞悬液，检查柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒等；采用家兔皮下注射，观察鼻病毒等；采用鸡胚不同部位接种，检查流感病毒、痘类病毒等。

3.在异种组织培养物上的检查

（1）在原代细胞上的检查：将待检细胞悬液接种于恒河猴肾、人胚肾、地鼠肾、兔肾或鸡胚细胞上培养7d，观察有无病变。

（2）在传代细胞上的检查：将上述材料接种于已长好的HeLa、HL或D-6细胞培养物中进行观察。

4.用已知的病毒核酸探针检查

将疑为污染的细胞进行核酸提取，采用已知病毒探针检测，或用已知病毒探针直接在细胞涂片上进行原位杂交。

二、微生物污染的排除

培养的细胞一旦被微生物污染应及时处理，防止造成本实验室中其他细胞的污染。一般细胞被污染最好高压灭菌后弃掉。如果是有价值的细胞被污染，并且污染的程度比较轻，可及时排除污染物，细胞可能恢复正常。常用的微生物污染的排除方法有以下几种。

（一）抗生素排除法

细胞培养中用抗生素是杀灭微生物的主要手段。各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防应用比污染后使用好。当已发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，而无杀菌效应。反复使用抗生素还会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此有人主张尽量不用抗生素处理。当然在一些有价值的细胞被污染后，仍需用抗生素挽救，在这种情况下，可采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养液中，有可能奏效。

各种支原体对抗生素的敏感性参见表1-18。

表1-18　各种支原体对抗生素的敏感性

注：＋表示敏感（MIC＜1μg／mL）；±表示部分敏感（MIC为1～10μg／mL）；-表示耐药（MIC＞10μg／mL）。

（二）热处理法

根据支原体对热耐受性差的特点，有人将受支原体污染的细胞于41℃下作用5～10 h，最长可达18h，以杀灭支原体。但41℃对培养细胞本身也有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间。

（三）动物体内接种

受微生物污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭污染的微生物，肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出再进行培养繁殖。

（四）与巨噬细胞共培养

在良好的体外培养条件下，巨噬细胞可存活7～10d，并可分泌一些细胞生长因子支持其他细胞的克隆生长。与体内的情况相似，巨噬细胞在体外培养条件下仍然可吞噬微生物并将其消化。利用96孔培养板将极少量的培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度的同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。

各种消除细胞污染的微生物方法都比较麻烦，仅用于重要的有保存价值的细胞。很容易重新培养的细胞受污染后，最好弃去。

知识拓展

支原体检测与去除技术的革命性变化

支原体的侵染带给研究者许多烦恼，因此对于支原体的监控就变得越来越重要。然而传统的支原体检测方法费时（一天到一周，甚至一个月），而且准确性不高（假阳性和假阴性较多）。Lonza推出的MycoAlert^?支原体检测试剂盒以其简便、快速和灵敏度高等特点，为支原体的检测带来了一场革命性的变化。另外，当发生支原体污染时，MyzoZap^?支原体去除试剂可以帮助去除支原体。

目前支原体的检测方法较多，常用的方法有以下几种。

（1）观察细胞的形态和生长特征，特点：支原体污染比较严重时可出现细胞生长减慢的现象，有的培养基pH值明显变小，并出现细胞病变，其病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。

（2）分离培养法，特点：大多数支原体可出现特有的典型菌落。该方法准确、可靠，但时间长、敏感性不够好。

（3）DNA结合荧光素染色法，特点：此法简便、价廉，但若细胞片制备不当，则结果难以判断。

（4）电镜和免疫电镜法，特点：此法较准确，但受设备条件限制、时间长、敏感性不好。

（5）间接免疫荧光法和免疫印迹法，特点：简便、快速、特异性较好，但仍会有荧光背景，影响判读。

（6）PCR技术，特点：快速、敏感性好，但若条件控制不当，容易出现假阴性和假阳性。

（7）MycoAlert^?支原体检测试剂盒发光法，特点：简便——加入试剂检测；快速——20min；通用——可检测所有支原体；灵敏度高——检出限低于50 cfu／mL。

思考题

1.在细胞培养中，微生物的污染主要包括哪些方面？

2.怎样判断所培养的细胞是否被微生物污染？

3.试述微生物污染排除的原则。

4.支原体污染的检测和排除方法分别有哪些？

5.一般原代细胞培养物污染的原因是什么？