实验三十九 拟南芥花粉表型的分析
【实验目的】
1.掌握花粉显微观察的一般方法。
2.掌握花粉细胞核DAPI染色的原理和方法。
3.掌握花粉活力的染色检测方法。
4.掌握体内和体外观察花粉管萌发的方法。
【实验原理】
花粉表型特征是花粉发育是否完善、活力是否正常的重要指标。表型异常的花粉，往往活力也会降低。如果突变体的花粉不能正常萌发，或者萌发率与野生型相比差异显著，可以初步推测突变基因可能影响了花粉发育的某个环节。
花粉萌发:花粉落到柱头上，萌发长出花粉管，花粉管伸长将两个精细胞运至胚珠和胚囊中，两个精细胞分别与卵细胞和中央细胞结合，从而完成双受精作用。成熟花粉在适当的体外培养条件下，也可以萌发生长。花粉的萌发力是检测花粉生活力的重要指标之一，通常以花粉萌发率来显示。拟南芥正常发育的花粉离体后在适宜条件下萌发率可达70%～100%。此外，花粉管的长度和形态也在一定程度上反映了花粉生活力的状况。
花粉离体萌发实验在研究中有多种用途。根据花粉萌发率、花粉管生长速率和表型分析不仅可以判断候选基因是否参与了花粉萌发的生理过程，也为研究目标基因参与调节花粉萌发和伸长过程的作用机制提供了依据。
DAPI染色: DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)可以特异地与核酸结合，在紫外光下发出蓝色荧光，因此可用于研究花粉细胞核发育是否正常。野生型成熟花粉中有1个营养细胞和2个精细胞，其中营养核因处于转录活性状态而染色弥散，生殖核因处于不转录或转录活性很低的异染色质状态而染色致密明亮。DAPI染色法操作简便，可显示发育过程中花粉细胞核的状态。
Alexander染色法:该方法也是判断花粉活力的一种简便方法。由纤维素构成的细胞壁可以被染色液中的孔雀石绿着色，而花粉原生质可以被染色液中的酸性品红着色。可育的、有活性的花粉被染成紫红色;不育或死的花粉由于原生质特性发生了变化，染色时呈现苍白或青蓝色。
TTC染色法: TTC染色法的原理是具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的NADH和NADPH可以将无色的TTC还原成红色的TTF;无活力的花粉呼吸作用较弱，则TTC颜色变化不明显。
脱色苯胺蓝染色法:该法可用于鉴定体内花粉萌发的状态。具有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上，不会被漂洗掉，可通过漂洗柱头并比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来推测其萌发率。花粉及花粉管壁的胼胝质与脱色苯胺蓝结合并被诱导产生荧光，在荧光显微镜下可观察到花粉粒在柱头上的萌发及花粉管伸长生长的情况。
【实验材料】
花期拟南芥植株。
【药品试剂】
1.脱色苯胺蓝: 0.1%苯胺蓝粉末溶于0.06mol/L磷酸缓冲液(用磷酸氢二钾和磷酸三钾配制，pH11)中，在搅拌器上搅拌至溶液蓝色褪去，溶液室温下避光保存。
2.花粉萌发液BK培养基: 5mmol/L硼酸，8mmol/L MgSO4·7H2O，1mmol/L KCl，5mmol/LCaCl2，10mmol/L肌醇，5mmol/L MES。蔗糖浓度为20%，用10mmol/L KOH调pH值至7.0。
3.FAA固定液: 95%乙醇∶冰醋酸∶福尔马林∶蒸馏水= 10∶1∶3∶7。
4.0.5% Safranin T(番红花红T)水溶液。
5.DAPI染色液: 0.1mol/L sodium phosphate，pH 7，1mmol/L EDTA，0.4mg/ml DAPI(4’-6二氨基-2-苯基吲哚)。4℃下可保存数周。
6.Alexander染色液:先配制50倍的染色液母液，组成为: 10ml 95%乙醇，5ml 1%孔雀石绿，5g苯酚，5ml 1%的酸性品红，0.5ml 1%的橘红G，2ml冰醋酸，25ml丙三醇，蒸馏水50ml。母液在棕色试剂瓶中避光保存。用前稀释，工作液为母液∶蒸馏水= 3∶47(V∶V)时效果最佳。
7.0.5% TTC溶液:称取TTC后加入少许95%乙醇使其溶解，然后用蒸馏水稀释至需要的浓度。溶液应避光保存，且一旦变红则不能使用。
【实验方法】
一、花粉的收集
1.将处于开花第13时期的花置于1.5ml离心管中。
2.加入花粉萌发液BK培养基200μl，并在振荡器上振荡5分钟。
3.10000r/min条件下离心5分钟。
4.除去上清液后重复步骤2和步骤3过程3次。
5.除上清液后加入100μl花粉萌发液BK培养基并混合均匀，用于花粉悬滴培养。
二、花粉离体培养
成熟花粉在适当的体外条件下可以正常萌发和生长，一定浓度范围内钙和硼离子在促进其萌发和生长过程中起着十分重要的作用。花粉在离体培养条件下亦可进行孢子体途径发育，形成单倍体植株。采用液体培养基的悬滴培养方法如下:
1.将混合均匀的花粉粒悬液约30μl滴到载玻片的中央，然后迅速翻转玻片，平放到3cm小培养皿上。注意在此之前将小培养皿放到一个较大的培养皿中并加入少量的水形成一个湿润的环境。
2.于23℃光照培养箱中培养后，可在倒置显微镜下观察其生长过程。
【注意事项】
将上述收集好的花粉用BK液悬浮，也可以平铺到萌发培养基上(含0.5%琼脂糖的BK萌发液)，将培养皿封口以保持湿度，放置于23℃光照恒温箱中培养，每隔4小时进行观察。8小时后，野生型拟南芥花粉萌发率即可达到50%～70%。
将花采摘后，干燥2小时，直接将花粉敲打在0.5%的琼脂培养基上，也可获得较高的萌发率。
三、花粉外形的观察
用BK萌发液收集成熟的拟南芥花粉，正常花粉水合后在光学显微镜下观察呈椭圆形，但一些基因的突变体可能会产生形态变异花粉，如干瘪状态花粉。取不同发育阶段的花序制作连续切片，可显示花粉发育在时间和空间上的进程，从而检测花粉异常表型出现的时期和可能的原因。
1.将拟南芥植株的花序在FAA固定液(95%乙醇∶冰醋酸∶福尔马林∶蒸馏水= 10∶1∶3∶7)中固定12～24小时。
2.用50%乙醇漂洗3次。
3.用正丁醇脱水、透腊、包埋和切片。常规石蜡切片厚度为7～10μm，脱色后用0.5% Safranin T染色，常规脱水、透明，封片后在显微镜下观察并拍照。
【注意事项】
用扫描和透射电镜技术可对花粉表型及细胞学特征进行精细的观察。花粉样品的制备与一般的电镜实验过程相同，花序材料经戊二醛前固定、pipes缓冲液冲洗、1%锇酸固定、树脂包埋、超薄切片及铜网捞取等步骤即可用透射电镜观察花粉细胞的发育情况;而扫描电镜可以用来观察花粉的表面结构以及花粉管在花柱通道中的生长情况。
四、花粉细胞核的观察
1.乙醇∶乙酸=3∶1的溶液中固定花蕾24小时。
2.将固定的花蕾保存于4℃，75%的乙醇中。
3.解剖花药将花粉释放到DAPI染液中，黑暗中染色30分钟。
4.在荧光显微镜下观察，细胞核呈现出蓝色荧光。
五、花粉生活力的鉴定
1.Alexander染色方法
(1)收集花粉，取少许花粉置于离心管中。
(2)向管内加入40ml Alexander工作液悬浮花粉，用避光纸(锡箔纸)包好，避光染色10～20分钟，涂于载玻片上，光镜下观察;通过统计染色率来判断花粉的活力。
2.TTC染色方法
(1)取少许花粉放在干净的载玻片上;
(2)加1～2滴TTC染色液，搅匀后置于35℃恒温箱中10～15分钟。
(3)盖上盖玻片镜检观察;通过统计染色率来判断花粉的活力。
六、花粉离体萌发及鉴定——脱色苯胺蓝染色法
1.取授粉后的雌蕊，在固定液(10%乙酸，30%氯仿，60%乙醇)中固定。
2.再浸泡于4mol/L NaOH溶液中，进行40分钟的透明软化处理。
3.用50mmol/L KPO4(pH7.5)缓冲液冲洗3次。
4.用0.01%脱色苯胺蓝染色10～15分钟。将染色后的材料转移到载玻片上，盖上盖玻片后在荧光显微镜下观察。
【注意事项】
取不同时期的雌蕊，于75%乙醇中固定24小时，用双蒸水清洗3次，然后于4mol NaOH中透明1～2天，待雌蕊全部透明后放置脱色苯胺蓝溶液中染色，紫外激发并观察。染色时间根据雌蕊的大小决定，可在紫外光下观察，如果发现染色时间不够，再进一步的加长时间进行染色。之后，在显微镜下观察并照相。
附:拟南芥开花时期及标志性事件
阶段标志性事件
1出现花原基隆起
2花原基形成
3花萼原基出现
4花萼覆盖在花分生组织上方
5花瓣和雄蕊原基出现
6花萼包住花芽
7长雄蕊原基基部长出柄
8长雄蕊出现房室
9花瓣原基基部长出柄
10花瓣与短雄蕊齐平
11柱头乳突出现
12花瓣与长雄蕊齐平
13花朵开放花瓣可见花药发生
14长花药超过柱头
15柱头超过长花药
16花瓣花萼凋谢
17所有器官从绿荚果上凋谢
18荚果变黄
19瓣膜与干荚果分离
20种子脱落
【注意事项】
1.在花粉采集时，选取处于开花第13时期的花，注意与处于第14时期的花区分开。
2.用苯胺蓝染色法鉴定花粉活体萌发情况时，苯胺蓝的染色时间由雌蕊组织的大小决定，可适当延长染色的时间。
3.TTC染色法还可以用于鉴定种子的活力。
【思考题】
检测花粉活力的方法有哪些?各有什么优缺点?
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